本發明專利技術的目的是提供一種用于對蝦細胞的啟動子，該啟動子的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2。應用本發明專利技術所設計的啟動子的表達載體則可以很好地解決此問題。當此載體的外源基因是報告基因或含有報告基因的融合蛋白時，該載體可通過在哺乳動物細胞中的報告基因表達來驗證其質粒構建的成功與否，然后將構建成功的質粒用于對蝦細胞轉染，提高對蝦細胞轉染成功率，減少對蝦細胞原代培養物的浪費，節約時間和成本，從而彌補現有技術的不足。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學重組表達
，具體設及一種用于對郵細胞的啟動 子。
技術介紹
對郵病毒病的頻繁爆發一直是困擾對郵養殖業并亟待解決的一個難題，而對郵永 生性細胞系是分離和純化對郵病毒、研究病毒的致病機理、發展有效的診斷試劑和防控技 術W及生產高效的病毒疫苗等的有利工具和研究手段。盡管國內外專家學者在對郵細胞的 體外培養和建系上進行了大量的探索和不懈的努力，但目前對郵的細胞培養仍然處于原代 培養水平，永生性的細胞系一直未能成功建立。 對郵細胞建系失敗的主要原因是體外培養對郵細胞的有絲分裂相極低，甚至不分 裂。已有人嘗試電離福射和化學誘變劑處理，W及將對郵細胞與腫瘤細胞融合，向培養基 中添加各種生長因子，等等，試圖誘導對郵細胞永生性轉化，但都沒有成功。由于在哺乳動 物細胞中，人們可W通過過表達癌基因和細胞周期調控相關基因，成功誘導細胞發生永生 性轉化。因此，1995年，Tapay等首次嘗試將猿猴病毒40 (SV40)大T抗原基因（SV40T)轉 染到南美藍對郵（Penaeusstylirostris)原代培養類淋己細胞中，雖然觀察到細胞變圓， 貼壁不緊，生長速度變快等轉化特征，但未能成功得到永生性對郵細胞系。隨后，Claydon 和0wens(2008)又嘗試將病毒（papillomavirus,HPV)癌基因E6andE7轉染到小龍郵 K虹taxqua化icarinatus)血細胞中，也未獲成功。化等（2008,2010)又利用逆轉錄病毒 載體介導SV40T基因在中國對郵原代培養類淋己細胞和卵巢細胞中的基因轉染。Shike等 (2000)又檢測了 4種哺乳動物來源啟動子在驅動巧光素酶報告基因在對郵細胞中表達上 的活性，運4個啟動子包括熱休克蛋白70化sp70)、桿狀病毒早期基因啟動子（IE-I)、莫洛 尼鼠白血病病毒（MMLV)和鳥勞氏肉瘤病毒巧SV)長末端重復序列化TR)啟動子。 遺憾的是，W上研究最后都沒有成功實現對郵細胞的永生性轉化。失敗的主要原 因可能與其采用哺乳動物來源基因和啟動子，導致在對郵細胞中不親和W及表達效率低有 關。體外培養對郵細胞難W被轉染，外源基因的整合與表達效率低，是與其細胞分裂不活躍 有關值ean等，2005)。運可能也是導致哺乳動物來源的許多強啟動子在對郵細胞中活性低 甚至無活性的主要原因。由此，有必要提供一種有效的適用于對郵細胞的啟動子。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種用于對郵細胞的啟動子，用于對郵細胞的轉染，從而彌 補現有技術的不足。 本專利技術首先提供一種啟動子，該啟動子的核巧酸序列為SEQIDN0:2。 上述的啟動子用于構建真核表達載體，該表達載體可使外源目的基因在對郵細胞 中高效表達。[000引本專利技術進一步提供了一種在對郵細胞中表達外源基因的方法，是用上述表達載體 將外源目的基因導入對郵細胞中。 因為對郵細胞不分裂，難W轉染，故驗證所構建表達質粒是否能正確表達存在困 難。應用本專利技術所設計的啟動子的表達載體則可W很好地解決此問題。當此載體的外源基 因是報告基因或含有報告基因的融合蛋白時，該載體可通過在哺乳動物細胞中的報告基因 表達來驗證其質粒構建的成功與否，然后將構建成功的質粒用于對郵細胞轉染，提高對郵 細胞轉染成功率，減少對郵細胞原代培養物的浪費，節約時間和成本，從而彌補現有技術的 不足。【附圖說明】 圖1 :啟動子Piei/2。。。的PCR擴增和3種表達載體的構建。A，PW/2。。。啟動子的PCR 擴增結果，經測序驗證，結果正確。B，pcDNA-Pc"-eGFP質粒圖譜。C，pcDNA-Pc"-Pw/2DDD-eGFP 的質粒圖譜。D，pcDNA-APemv-Piel/2000-eGFP(無Pemv啟動子）的質粒圖譜。[00川圖 2 :3 種表達質粒pcDNA-Pcmv-eGFP(A和Al)、pcDNA-Pcmv-Piei/a?0-eGFP度和BI)和pcDNA-APc"-Pw/2<Me-eGFP(C和Cl)轉染哺乳動物細胞Plat-GP的巧光表達結果。A、B和 C為轉染后4她的光鏡照片。AUBl和Cl為轉染后4她的巧光照片。[001引圖3 :3種表達質粒pcDNA-Pcmv-eGFP(A和Al)、pcDNA-Pcmv-Piei/a?0-eGFP度和BI)和pcDNA-APe"-Pw/2DDD-eGFP(C和Cl)轉染哺乳動物神經瘤細胞化uro2A的巧光表達結果。 A、B和C為轉染后4她的光鏡照片。AU Bl和Cl為轉染后4她的巧光照片。[001 引 圖 4 :3 種表達質粒pcDNA-Pcmv-eGFP(A和Al)、pcDNA-Pcmv-Piei/a?0-eGFP度和BI)和pcDNA-APc"-Pw/2e<M-eGFP(C和Cl)轉染魚類細胞FG的巧光表達結果。A、B和C為轉染 后4她的光鏡照片。AUBl和Cl為轉染后4她的巧光照片。圖 5 :表達質粒pcDNA-Pcmv-Piei/2000-eGFP (A和Al)和pcDNA- A Pcmv-Piel/2000-eGFP度 和BI)轉染對郵類淋己組織原代培養細胞后，未見明顯巧光信號。A和B為轉染后4她的光 鏡照片。Al和Bl為轉染后48h的巧光照片。[001引圖：6 :對郵WSSV病毒iel基因啟動子Pw/2。。。的序列及其轉錄因子結合位點分析， 長度2000bp。[001引圖7康達質粒pcDNA-Pemv-mCherry的圖譜。圖8 :PCR擴增mCher巧基因編碼區和突變啟動子Piei/519的電泳結果。M，DNAmarker。泳道1為mCherry基因擴增產物，泳道2為啟動子Pw/519擴增產物。[001 引圖 9:表達質粒pcDNA-Pemv-Piei/519-mCher巧的圖譜。[001 引 圖 10 :表達質粒pcDNA-Pcmv-Piei/sig-mOierry(A和Al)和pcDNA-Pcmv-mOierry度和BI)轉染哺乳動物神經瘤細胞，可觀察到強紅色巧光表達，且前者（Al)巧光比后者度1)弱。 A和B為光鏡照片。Al和Bl為巧光照片。圖11:表達質粒pcDNA-Pcmv-mCher巧(A和Al)和pcDNA-Pcmv-Piei/519-mCher巧度和BI)轉染對郵原代培養類淋己細胞后，前者無紅色巧光表達，后者有紅色巧光表達。A和B 為光鏡照片。Al和Bl為巧光照片。【具體實施方式】[002。 申請人在研究中發現，對郵WSSV病毒的iel基因啟動子片段（核巧酸序列SEQID NO:I)不能驅動外源基因在對郵細胞中有效表達，因此，申請人對該啟動子的轉錄因子結合 位點進行了詳盡的分析，并選擇性地對其進行了截短。改進后的對郵WSSV病毒iel基因啟 動子片段（核巧酸序列S當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種啟動子，其特征在于，所述的啟動子的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王雨杰，王雨豪，濮龍軍，郭華榮，
申請(專利權)人：中國海洋大學，
類型：發明
國別省市：山東;37
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