本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種高產(chǎn)β-淀粉酶的彎曲芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明專利技術(shù)的彎曲芽孢桿菌于2015年6月14保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2015368。本發(fā)明專利技術(shù)的彎曲芽孢桿菌，β-淀粉酶活達到121U/mL，其生產(chǎn)的β-淀粉酶的最適pH7.0、最適溫度為50℃、在50℃條件下半衰期可達26h。利用本發(fā)明專利技術(shù)的β-淀粉酶以10％馬鈴薯淀粉液化液為底物，在pH6.0，50℃條件下與普魯藍酶復(fù)配進行糖化，主要產(chǎn)物為麥芽糖和麥芽三糖，糖化24h麥芽糖轉(zhuǎn)化率超過75％，可用于高麥芽糖漿制備、啤酒等食品發(fā)酵行業(yè)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及，屬于生物工程
技術(shù)介紹
β _淀粉酶又稱為麥芽糖苷酶、糖原淀粉酶，其系統(tǒng)名為α _1，4_匍聚糖_4_麥芽糖水解酶(α -1, 4-Dglucan maltohydrolase)，E.C.編號為 3.2.1.2.，作用于淀粉時，從其非還原性末端順次切下麥芽糖，水解產(chǎn)物是麥芽糖、極限糊精及非常少量的β -葡萄糖。β -淀粉酶具有相當(dāng)大的工業(yè)應(yīng)用價值，長期以來植物來源的大麥β -淀粉酶一直被廣泛用于多個領(lǐng)域。例如，在啤酒發(fā)酵業(yè)中部分代替大麥芽用于啤酒的生產(chǎn)，在食品業(yè)中用于水解淀粉制造麥芽糖漿和飴糖等。自1974年Higashihara等人首次確定巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)胞外淀粉酶含有淀粉酶以來，相繼發(fā)現(xiàn)了幾種能夠產(chǎn)生該酶的微生物，這些菌株大都屬于細(xì)菌，如蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、多粘芽孢桿菌(B.polymyxa)、環(huán)狀芽抱桿菌(B.circulans)、高溫放線菌(Thermeoactinomyces sp.)和熱硫梭菌(Clostridium thermosulfurogenes)等。與植物β -淀粉酶相比，微生物來源的β -淀粉酶具有便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點，因此篩選尋找理想的微生物β -淀粉酶源成為淀粉酶研究應(yīng)用領(lǐng)域的一個重要目標(biāo)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的第一個目的是提供一種高產(chǎn)淀粉酶的彎曲芽孢桿菌(B.flexus)，于2015年6月14號保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2015368，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。所述彎曲芽孢桿菌，系從菜地土壤中分離得到的。彎曲芽孢桿菌的篩選方法是從菜地土壤中經(jīng)平板菌落特征初篩，采用一級發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)，得到的菌液離心取上清。取適量上清液加入到裝有15mL10%可溶性淀粉溶液的三角瓶中，在50°C水浴搖床中搖24h，所得產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)以麥芽糖為主，則此酶為β-淀粉酶。經(jīng)酶活測定，比較淀粉酶活性大小而得到產(chǎn)量較高的菌株。對該菌株進行16S rDNA鑒定，鑒定為彎曲芽孢桿菌。本專利技術(shù)的第二個目的是提供一種利用所述彎曲芽孢桿菌生產(chǎn)β -淀粉酶的方法。所述方法是以彎曲芽孢桿菌CCTCC Ν0:Μ2015368為生產(chǎn)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵制得β -淀粉酶。在本專利技術(shù)的一種實施方式中，所述液體深層發(fā)酵是在37°C、200rpm下發(fā)酵時間36h0在本專利技術(shù)的一種實施方式中，所述液體深層發(fā)酵使用的發(fā)酵培養(yǎng)基含有:可溶性淀粉15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、氯化鈉5g/L。在本專利技術(shù)的一種實施方式中，所述種子培養(yǎng)是在溫度37°C、搖床轉(zhuǎn)速200rpm下培養(yǎng)時間為10-12h ;其中所用的種子培養(yǎng)基含有:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L。本專利技術(shù)還要求保護所述彎曲芽孢桿菌生產(chǎn)的β -淀粉酶及其應(yīng)用，尤其是食品領(lǐng)域的應(yīng)用。本專利技術(shù)的有益效果:本專利技術(shù)提供了一種高產(chǎn)β -淀粉酶的彎曲芽孢桿菌，β -淀粉酶活達到121U/mL。本專利技術(shù)菌株生產(chǎn)的β -淀粉酶的最適ΡΗ7.0、最適溫度為50°C、在50°C條件下半衰期可達26h0利用本專利技術(shù)的淀粉酶以10%馬鈴薯淀粉液化液為底物，在pH6.0，50°C條件下與普魯藍酶復(fù)配進行糖化，主要產(chǎn)物為麥芽糖和麥芽三糖，糖化24h麥芽糖轉(zhuǎn)化率超過75%，可用于高麥芽糖漿制備、啤酒等食品發(fā)酵行業(yè)。生物材料保藏:彎曲芽孢桿菌，分類學(xué)命名為彎曲芽孢桿菌FB-2014_6Bacillus flexusFB-2014-6，于2015年6月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址為武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC N0:M2015368o【附圖說明】圖1: β -淀粉酶最適pH值；圖2: β -淀粉酶最適溫度；圖3: β -淀粉酶熱穩(wěn)定性；圖4: β -淀粉酶糖化產(chǎn)物。【具體實施方式】一個β -淀粉酶酶活單位(1U)定義(U/mL):lmL酶液在ρΗ7.0，溫度50°C，lh水解可溶性淀粉生產(chǎn)lmg麥芽糖所需的酶量稱為一個酶活力單位。 測定方法:準(zhǔn)確吸取0.5mL2 %可溶性淀粉溶液，置于20mL比色管中，加0.4mL50mMpH7.0磷酸鹽緩沖溶液，搖勻，于50°C水浴預(yù)熱5min，準(zhǔn)確加入100 μ L酶液，立即計時，搖勾，于50°C水浴準(zhǔn)確保溫酶解反應(yīng)lOmin，立即加入DNS0.8mL，搖勻，并煮沸5min，冰水中冷卻。以同樣條件下用緩沖液代替酶液的反應(yīng)體系作為對照，上述反應(yīng)體系加10.2mL蒸餾水，混勾，lcm比色皿，540nm波長下測吸光度㈧。根據(jù)吸光度求得測試酶液的濃度。β -淀粉酶酶活計算公式:X = (1.2736Α54。-0.0046) η式中:X—樣品的酶活力，U/mL ；A54o一 540nm下吸光度之差；η—樣品的稀釋倍數(shù)。可溶性淀粉溶液(20g/L):稱取2.000g可溶性淀粉(以絕干計)于燒杯中，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩慢加入50mL沸水中，然后用水分次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌并加熱至完全透明，用緩沖液冷卻定容至100mL。淀粉溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。50mM磷酸緩沖液(pH = 7.0):稱取17.6g十二水合磷酸氫二鈉和7.8g 二水合磷酸二氫鈉，分別用水溶解并定容至lOOOmL。取適量體積混合并用pH計校準(zhǔn)至7.0后使用。50mM Britton-Robinson Buffer Solut1n (伯瑞坦-羅比森緩沖溶液):在 100ml三酸混合液(磷酸、乙酸、硼酸，濃度均為0.04mol/L)中，加入適量體積的0.2mol/LNa0H，調(diào)至相應(yīng)pH值。實施例1:菌株篩選按“五點取樣法”分別從無錫市濱湖區(qū)5處菜地土壤采取土樣10份，共30份土壤。從30份土樣中中分離目的菌株。將取得的土壤當(dāng)前第1頁1 2 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種彎曲芽孢桿菌，其特征在于，所述彎曲芽孢桿菌于2015年6月14號保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO:M?2015368，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳敬，段緒果，亓旭輝，
申請(專利權(quán))人：江南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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