本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種使用被設(shè)計成解決傳統(tǒng)等位基因特異性PCR的問題的等位基因特異的反應(yīng)性引物(ASRP)來擴(kuò)增核酸的方法，更具體地，本發(fā)明專利技術(shù)涉及靶核酸的檢測方法，包括具有校對活性的DNA聚合酶和與靶核酸互補(bǔ)的堿基序列，其中在ASRP存在下擴(kuò)增靶核酸，所述ASRP被修飾為使得位于來自與引物5’方向上不互補(bǔ)的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區(qū)域中的一個或多個修飾核苷酸，在3'端存在不互補(bǔ)的核苷酸時，該不互補(bǔ)的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以使等位基因特異的反應(yīng)性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應(yīng)的引物。根據(jù)本發(fā)明專利技術(shù)的使用ASRP的檢測方法由于ASRP和校對DNA聚合酶的特性而成為具有非常高特異性的技術(shù)，并且能夠有效地檢測包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)在內(nèi)的突變(點(diǎn)突變、插入、缺失)。此外，該方法也可以用于檢測亞硫酸氫鹽處理后的CpG甲基化的存在，或者擴(kuò)增并檢測DNA文庫中從所需核苷酸序列開始的靶DNA。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及一種使用被設(shè)計成解決傳統(tǒng)等位基因特異性PCR的問題的等位基因 特異的反應(yīng)性引物（ASRP)來擴(kuò)增核酸的方法，更具體地，涉及用于檢測靶核酸的方法，該 方法包括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)存在下擴(kuò)增 靶核酸，所述ASRP包括：i)與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，和ii) 一個或多個修飾核苷酸，位 于來自與引物5'方向上不互補(bǔ)的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區(qū)域 中，在3'端存在不互補(bǔ)的核苷酸時，該不互補(bǔ)的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以 使等位基因特異的反應(yīng)性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應(yīng)的引物。
技術(shù)介紹
單核苷酸多態(tài)性（SNP)是當(dāng)一個單核苷酸被其它三種核苷酸之一替換時發(fā)生的 DNA序列的遺傳變異。它導(dǎo)致個體間的差異，如致病原因或?qū)χ委熕幬锏姆磻?yīng)。單核苷酸多 態(tài)性的檢測和鑒定不僅與個性化的藥物相關(guān)聯(lián)，也與新藥開發(fā)相關(guān)聯(lián)，因此已經(jīng)受到了大 量的關(guān)注。 對于單核苷酸多態(tài)性的快速檢測，已使用基于實(shí)時PCR技術(shù)的各種檢測方法。這 些檢測方法的典型實(shí)例包括使用DNA嵌入熒光染料的測定法，使用DNA探針的測定法和 使用PNA探針的測定法。然而，這些方法的缺點(diǎn)在于使用DNA嵌入熒光染料是受限的并 且需要使用用于分析恪解曲線的程序（KirkM.Ririeetal·，AnalyticalBiochemistry 245:154, 1997 ;U.Hladniketal·，ClinExpMed, 2:105,2002)。 具有3' 一 5'校對活性的DNA聚合酶確保了DNA復(fù)制的高保真性（Drake，J. ff.et.al.,ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol. , 33:339, 1968 ；Drake,J.ff.et. al.，Nature, 221:1128, 1968 ;Goodman,M.F.et.al. ·Genetics, 148:1475, 1998)，并且已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)了很多具有3'核酸外切酶活性的校對聚合酶。 具有fe對活性的DNA聚合酶確保了體內(nèi)DNA復(fù)制的尚保真性，但是，當(dāng)將具有 校對活性的DNA聚合酶應(yīng)用到利用常規(guī)等位基因特異性的引物所進(jìn)行的聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)時，存在這樣的問題，即，因?yàn)樵?'端不匹配的堿基被除去，所以無論引物與用作 模板的DNA是完全雜交或是不完全雜交，引物的末端都會延伸（Zhang,J.etal.，Mol. Biotechnol. , 24:105, 2003) 〇 由于這個問題，在研究突變檢測中幾乎不使用具有校對活性的DNA聚合酶。然而 近幾年，已經(jīng)出現(xiàn)了針對于使用修飾引物的3'端的方法來檢測靶核酸中的突變的方法的研 究，例如標(biāo)記引物的3'端或?qū)?'核酸外切酶抗性因子綴合至3'端的方法，或除去核苷酸 的3'端的-0H基團(tuán)或用其他殘基置換該-0H基團(tuán)的方法（Zhang,J.etal.，CurrentDrug Disc. , 9:21, 2001 ；Bi,ff.L.andSambrook,P.J. ,NucleicAcidsRes. , 26:3073, 1998) 〇例如，在引物的3'端被標(biāo)記的情況下，當(dāng)引物互補(bǔ)結(jié)合到模板DNA時，產(chǎn)生擴(kuò)增終 產(chǎn)物，同時在3'端的標(biāo)簽被保持，但是當(dāng)引物不匹配模板DNA時，在3'端的標(biāo)簽被具有校 對活性的DNA聚合酶在校對時去除，因此產(chǎn)生不含標(biāo)簽的擴(kuò)增終產(chǎn)物，這表明可以基于標(biāo) 記的存在或不存在來檢測突變。基于這個原理，可以將具有以各種方式進(jìn)行3'端修飾的等 位基因特異性引物，以及具有校對活性的DNA聚合酶，應(yīng)用于包括實(shí)時PCR、多孔板和微陣 列技術(shù)的各種平臺。因此，本專利技術(shù)人進(jìn)行了廣泛的努力，以使用3'端修飾的引物和具有校對活性的DNA聚合酶來檢測靶核酸，并且結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在具有校對活性的DNA聚合酶存在下，使用其中 核苷酸的3'端被修飾的等位基因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)，特異地擴(kuò)增出靶核酸，從而完 成了本專利技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
技術(shù)問題 本專利技術(shù)的一個目的是提供一種使用等位基因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)來檢測靶 核酸的方法，以及用于從DNA文庫選擇性地擴(kuò)增靶核酸的方法，所述等位基因特異反應(yīng)性 引物（ASRP)包括與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，以及一個或多個修飾核苷酸，位于來自與引 物5'方向的不互補(bǔ)的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區(qū)域中，在3'端存 在不互補(bǔ)的核苷酸時，該不互補(bǔ)的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以使在等位基 因特異的反應(yīng)性引物中的核苷酸不能充當(dāng)聚合酶反應(yīng)的引物。 技術(shù)方案 為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)提供了一種用于檢測靶核酸的方法，該方法包括在具 有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)存在下，擴(kuò)增靶核酸，所述 等位基因特異反應(yīng)性引物（ASRP)包括：i)與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，和ii) 一個或多個 修飾核苷酸，位于來自與引物5'方向的不互補(bǔ)的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的 核苷酸的區(qū)域中，在3'端存在不互補(bǔ)的核苷酸時，該不互補(bǔ)的核苷酸將被DNA聚合酶的校 對活性除去，以使在等位基因特異的反應(yīng)性引物中的核苷酸不能充當(dāng)聚合酶反應(yīng)的引物。 本專利技術(shù)還提供從DNA文庫擴(kuò)增以特定核苷酸序列開始的靶核酸的方法，該方法包 括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)存在下，從DNA文庫 中擴(kuò)增靶核酸，所述靶核酸包括在其5'端與DNA文庫的接頭序列互補(bǔ)的核苷酸序列，和在 3'端與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列和修飾核苷酸，以便在等位基因特異的反應(yīng)性引物中的核 苷酸不能作為聚合酶反應(yīng)的引物。 本專利技術(shù)還提供了一種用于檢測靶核酸的方法，該方法包括在下述物質(zhì)存在下擴(kuò)增 靶核酸：（i)等位基因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)，所述ASRP包括在其5'端包含與靶核酸不 互補(bǔ)的核苷酸序列的標(biāo)簽序列，修飾單核苷酸和與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，所述等位基 因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)在其3'端具有一個或多個使得在等位基因特異的反應(yīng)性引物 中的核苷酸不能作為聚合酶反應(yīng)引物的修飾核苷酸；（ii)標(biāo)簽序列和報告子模板，所述報 告子模板含有與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列的一部分；和（iii)具有3' 一5'核酸外切酶活 性的DNA聚合酶。【附圖說明】 圖1是示出利用等位基因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)的檢測系統(tǒng)的示意圖。 圖2示出使用通用引物和ASRP檢測單核苷酸突變來進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 圖3示出使用通用引物和ASRP檢測甲基化來進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖4是示出使用等位基因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)從DNA文庫擴(kuò)增從所需核苷 酸序列開始的靶DNA的過程的示意圖。 圖5是示出使用等位基因特異的反應(yīng)性引物（ASRP)和具有3' 一 5'核酸外切酶 活性且沒有校對活性的DNA聚合酶的檢測系統(tǒng)的示意圖，該ASRP包括標(biāo)簽序列，修飾單核 苷酸和與靶核酸互補(bǔ)的靶特異性序列。【具體實(shí)施方式】 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本專利技術(shù)所屬領(lǐng)域的技 術(shù)人員的通常理解相同的含義。通常，本文中使用的命名法是眾所周知且在本領(lǐng)域中常用 的。 在一個方面，本專利技術(shù)涉及一種檢測靶核酸的方法，該方法包括在具有校對本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種用于檢測靶核酸的方法，該方法包括在具有校對活性的DNA聚合酶和等位基因特異的反應(yīng)性引物(ASRP)存在下，擴(kuò)增靶核酸，該等位基因特異的反應(yīng)性引物包括i)與靶核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，和ii)一個或多個修飾核苷酸，位于來自與引物5’方向上不互補(bǔ)的核苷酸緊鄰的核苷酸到位于引物5'端的核苷酸的區(qū)域中，在3'端存在不互補(bǔ)的核苷酸時，該不互補(bǔ)的核苷酸將被DNA聚合酶的校對活性除去，以使等位基因特異的反應(yīng)性引物中的核苷酸不能作為聚合酶反應(yīng)的引物。
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：安城皖，吳泰禎，
申請(專利權(quán))人：基因特力株式會社，
類型：發(fā)明
國別省市：韓國;KR
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