檢測循環腫瘤細胞的電化學免疫傳感器的制備及應用制造技術

本發明專利技術公開了一種差分脈沖伏安法檢測循環腫瘤細胞的傳感器。該傳感器的制備,包括以下步驟：按照現有方法制備出五氧化二釩納米線，金銀核殼納米粒子；將五氧化二釩納米線-金銀核殼納米粒子結合修飾適配體；將金納米粒子修飾于電極表面，后連接硫醇化的適配體，特異性結合循環腫瘤細胞，再連接五氧化二釩納米線-金銀核殼納米粒子修飾的適配體；將制作好的電化學傳感器結合電化學工作站對循環腫瘤細胞進行檢測；利用電化學工作站檢測。本發明專利技術的傳感器特異性強，靈敏度高，操作簡單，檢測限低。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及細胞檢測
，更具體的說是一種通過半導體催化產生還原電流，合金增強還原電流，從而檢測循環腫瘤細胞個數，屬于超靈敏的電化學細胞免疫傳感器的制備技術。
技術介紹
近年來，免疫分析是臨床檢驗中一項重要的腫瘤疾病的診治手段。一直以來，惡性腫瘤也就是癌癥是人類健康和生命安全的一個嚴重威脅。癌癥細胞，是指一些擁有分裂潛能的細胞在致癌因素的作用下發生了惡性轉化和克隆性增生而產生的一種新生物。并且癌細胞除了自身的生長失控外，還會侵入周遭正常組織甚至可以經由體內的循環系統或者淋巴系統轉移到身體的其他部分，從而引起身體病變甚至死亡。所以，癌癥早期的診斷和及早的治療具有重要的意義。但是癌癥早期的癌細胞含量較低很難被發現，低含量的癌癥細胞的測定成為了分析人員的重要追求。免疫分析主要是基于用抗體(或抗原)作為選擇性化學試劑以分析測定抗原(或抗體)及半抗原。它的提出及發展是生物分析化學最偉大的成就之一估計全世界每年要進行數億次的免疫分析。免疫分析中發展快、應用廣的首推放射免疫分析法(RIA)，RIA主要優點是，儀器自動化，操作簡便，靈敏度高，樣品制備簡單；同時，由于臨床樣品中不存在放射活性物質，因而干擾少。然而，RIA需要進行放射性操作，儀器價格又貴，這便激發了科學家們努力探索非放射性標記的免疫分析方法，迅速發展起來了酶聯免疫分析(ELISA)、發光免疫分析(LIA)、電化學免疫分析(ECIA)等方法。但是這些免疫分析方法一般耗時較長并且擁有繁瑣的加樣、溫育、洗滌等操作過程，而且操作人員和免疫物質的接觸較多，可能對操作的人員的身體健康造成危害。而且有些測定速度快、靈敏度高、檢測性低的檢測手段需要儀器昂貴，不能在發展中國家普及。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供了一種靈敏度高、檢測速度快、試劑用量少，檢測循環腫瘤細胞的電化學免疫傳感器。為了解決上述技術問題，本專利技術是通過以下措施來實現的:一種檢測循環腫瘤細胞的電化學傳感器的制備及應用方法，其包括以下步驟: (1)按照現有方法制備出五氧化二銀納米線，金銀核殼納米粒子； (2)將五氧化二銀納米線-金銀核殼納米粒子結合修飾適配體； (3)將金納米粒子修飾于電極表面，后連接硫醇化的適配體，特異性結合循環腫瘤細胞，再連接五氧化二銀納米線-金銀核殼納米粒子修飾的適配體； (4)將制作好的電化學傳感器結合電化學工作站對循環腫瘤細胞進行檢測。本專利技術所述五氧化二釩納米線-金銀核殼納米粒子結合修飾適配體及電化學傳感器的制備及應用包括以下步驟: (1)五氧化二釩納米線的制備:其特征是將水溶性的硫酸氧釩與氧化劑溴酸鉀在室溫下混合，磁攪拌反應30 min，后通過硝酸降低酸度，將混合物水溶液在高壓釜中以180 V反應24 h，取出高壓釜冷卻至室溫，二次水多次沖洗得深黃色沉淀，將沉淀在80 °(:烘箱中烘干備用； (2)金納米粒子儲備液的制備:其特征是將1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL 二次水，置于100 mL容量的三口圓底燒瓶中，在磁攪拌的情況下加熱30 min，后加入2.5 mL1 %的檸檬酸鈉，10 min內溶液先由黃色變為藍灰色，最后變為軟粉色，溶液經過離心和二次水洗，后再分散于二次水中，得到金納米粒子儲備液； (3)金銀核殼納米粒子的制備:其特征是將7mL (2)制備的金納米粒子儲備液與0.65mL 0.1 %聚乙烯吡咯烷酮混合，磁攪拌20 min，后加入1.5 mL 0.05 mM的β -環糊精和1.5mL 0.05 mM的半胱氨酸，磁攪拌幾分鐘混勾。加入氫氧化鈉溶液孵化10 min調整pH至10，將混合溶液85 ° C水浴。后連續磁攪拌30 min，逐滴加入3 mL 0.1 mM的硝酸銀溶液，滴加過程中，溶液逐漸由粉色變為亮黃色，得到金銀核殼納米粒子； (4)五氧化二f凡納米線-金銀核殼納米粒子的制備:其特征是將(1)制備的五氧化二鑰^納米線取10 mg溶解于1 mL二次水中，加入1 %的氯化己二稀二甲基胺溶液，超聲30 min,離心水洗4次，后加入(3)制備的金銀核殼納米粒子0.5 mL，磁攪拌1 h，沉淀離心水洗多次至顏色不變，最后獲得五氧化二釩納米線-金銀核殼納米粒子； (5)制備五氧化二f凡納米線-金銀核殼納米粒子修飾的適配體:其特征是先由0.1 Μ的氫氧化鈉調整五氧化二釩納米線-金銀核殼納米粒子的pH至9，后加入50 yL的5 μ Μ硫醇化適配體，混合溶液在4 ° C條件下磁攪拌12 h，后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌，棄去上層清液，將沉淀溶解于含有1 mM Ca2+，1 mM Mn2+和0.1 %牛血清白蛋白的孵化緩沖液中，4 ° C下放置備用； (6)玻碳電極的修飾:其特征是將清洗好的玻碳電極插入2mL1 mM的氯金酸，在-0.2V電壓下電沉積40 s，修飾上金納米粒子，磷酸鹽緩沖溶液沖洗，晾干備用； (7)將(6)修飾好的玻碳電極連接硫醇化的適配體，其特征是由6-巰基-1-己醇封裝位點，接著捕獲循環腫瘤細胞，連接五氧化二銀納米線-金銀核殼納米粒子修飾的適配體，電極插入包含25 μ Μ硫堇的0.01 Μ磷酸鹽緩沖溶液中，通過差分脈沖伏安法檢測還原電流得到結果。本專利技術中使用的洗滌溶液為pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液。本專利技術所述循環腫瘤細胞為乳腺癌細胞(MCF-7和T47D)。本專利技術的有益效果: (1)本專利技術利用差分脈沖伏安法進行測定，操作快速簡單，反應及結果均由儀器自動完成和記錄，避免了主觀因素的影響，并保證有很好的重復性； (2)利用生物活性穩定、催化性質良好的五氧化二釩作為催化劑，并且五氧化二釩可以在雙氧水存在的條件下催化染料小分子，產生還原電流； (3)金銀核殼納米粒子具有高導電性，同時放大了還原電流，起到放大信號作用。【附圖說明】圖1所示為本專利技術流程圖。A所示為金納米粒子；B所示為適配體；C所示為循環腫瘤細胞山所示為五氧化二鑰i內米線；e所示為金銀核殼納米粒子?！揪唧w實施方式】—種檢測循環腫瘤細胞的電化學傳感器的制備及應用方法，其包括以下步驟: (1)按照現有方法制備出五氧化二銀納米線，金銀核殼納米粒子； (2)將五氧化二銀納米線-金銀核殼納米粒子結合修飾適配體； (3)將金納米粒子修飾于電極表面，后連接硫醇化的適配體，特異性結合循環腫瘤細胞，再連接五氧化二銀納米線-金銀核殼納米粒子修飾的適配體； (4)將制作好的電化學傳感器結合電化學工作站對循環腫瘤細胞進行檢測。本專利技術所述五氧化二釩納米線-金銀核殼納米粒子結合修飾適配體及電化學傳感器的制備及應用包括以下步驟: (1)五氧化二釩納米線的制備:其特征是將水溶性的硫酸氧釩與氧化劑溴酸鉀在室溫下混合，磁攪拌反應30 min，后通過硝酸降低酸度，將混合物水溶液在高壓釜中以180 V反應24 h，取出高壓釜冷卻至室溫，二次水多次沖洗得深黃色沉淀，將沉淀在80 °(:烘箱中烘干備用； (2)金納米粒子儲備液的制備:其特征是將1.25 mL 10 mM的氯金酸加入42.65 mL 二次水，置于100 mL容量的三口圓底燒瓶中，在磁攪拌的情況下加熱30 min，后加入2.5 mL1 %的檸檬酸鈉，10 min內溶液先由黃色變為藍灰色，最后變為軟本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測循環腫瘤細胞的電化學傳感器的制備方法，其包括以下步驟：首先，按照現有方法制備出五氧化二釩納米線，金銀核殼納米粒子；然后，將五氧化二釩納米線?金銀核殼納米粒子結合修飾適配體，先由0.1?M的氫氧化鈉調整五氧化二釩納米線?金銀核殼納米粒子的pH至9，后加入50?μL的5?μM硫醇化適配體，混合溶液在4?°C條件下磁攪拌12?h，后用磷酸鹽緩沖溶液洗滌，棄去上層清液，將沉淀溶解于含有1?mM?Ca2+，1?mM?Mn2+和0.1?%牛血清白蛋白的孵化緩沖液中，4?°C下放置備用；最后，將清洗好的玻碳電極插入2mL?1?mM的氯金酸，在?0.2?V電壓下電沉積40?s，修飾上金納米粒子，磷酸鹽緩沖溶液沖洗，晾干備用，后連接硫醇化的適配體，由6?巰基?1?己醇封裝位點，接著特異性結合循環腫瘤細胞，再連接五氧化二釩納米線?金銀核殼納米粒子修飾的適配體。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：顏梅，鄧文平，于京華，葛慎光，劉海云，張彥，申蕾，王秀，楊春蕾，朱少軍，楊光鑫，
申請(專利權)人：濟南大學，
類型：發明
國別省市：山東;37