催化多酚糖基化的酶制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及催化多酚，特別是黃酮類化合物、苯甲酸衍生物、芪類化合物、查爾酮類化合物、色酮類化合物和香豆素衍生物糖基化的酶。在一個(gè)方面，本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種催化多酚糖基化的酶，其中所述酶a)包含SEQ?ID?NO：7-12的序列之一的氨基酸序列；或b)由包含SEQ?ID?NO：1-6的序列之一的核苷酸序列的核酸編碼；或c)與上述a)或b)限定的酶之一同源；或d)由一個(gè)核酸編碼，所述核酸在嚴(yán)格條件下與互補(bǔ)于包含SEQ?ID?NO：1-6的序列之一的核苷酸序列的核酸雜交。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】【專利說明】催化多酚糖基化的酶 本專利技術(shù)涉及催化多酚，特別是黃酮類化合物、苯甲酸衍生物、芪類化合物、查爾酮 類化合物、色酮類化合物和香豆素衍生物糖基化的酶。 多酚是通過莽草酸和苯丙烷途徑生物合成的植物次生代謝產(chǎn)物。它們是在它們的 環(huán)系統(tǒng)具有羥基的芳族化合物或其衍生物。黃酮類化合物和苯甲酸衍生物是多酚的例子。 經(jīng)由環(huán)系統(tǒng)中的羥基的二次修飾，形成這些化合物的多種天然衍生物。糖修飾在自然界中 經(jīng)常發(fā)生，因?yàn)樗鼈儗?duì)化合物的溶解度和功能可能有顯著影響。多酚化合物是水果和蔬菜 形式的我們?nèi)粘I(yíng)養(yǎng)中的一部分，并且已知對(duì)人類健康具有積極的影響。除了抗氧化和自 由基清除功能外，它們能夠發(fā)揮例如抗過敏、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛以及甚至 癌保護(hù)（21)作用。由于這些廣泛影響，在化妝品工業(yè)、制藥工業(yè)和營(yíng)養(yǎng)制品工業(yè)中對(duì)多酚 類物質(zhì)如具體的黃酮類化合物的需求日益增長(zhǎng)（22-24)。滿足這一需求的主要問題來自它 們的可利用性有限。例如，黃酮類化合物僅僅以低水平在植物中產(chǎn)生。提取與大量溶劑的 使用有關(guān)，且由于它們相當(dāng)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)化學(xué)修飾不容易實(shí)現(xiàn)（25)。由于定向化學(xué)修飾大多失敗，多酚如黃酮類化合物的區(qū)域?qū)Ｒ恍孕揎椚匀缓芾?難。因此，酶已經(jīng)獲得了關(guān)注，因?yàn)樗鼈兡軌蚪閷?dǎo)多酚的區(qū)域修飾和立體化學(xué)修飾（26)。特 別是，研究集中于特定的糖基化，作為修飾影響多酚例如黃酮類化合物的水溶性和生物利 用率（27, 28)。催化反應(yīng)的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶（GT)。通常，GT介導(dǎo)糖殘基從供體底物到受體 分子的轉(zhuǎn)移。基于它們的序列相似性，GT目前分類為94個(gè)家族（29)。GT家族1(GT1)包括 催化親脂性小分子糖基化的酶（30)。使用核苷酸活化的供體的這些酶（EC 2.4. 1.x)屬于 UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT)超家族，并且也被稱為L(zhǎng)eloir酶（31，32)。作用于黃酮類化合物的 糖基轉(zhuǎn)移酶也屬于GT1 (33)。GT1的酶具有GT-B折疊結(jié)構(gòu)并呈現(xiàn)出關(guān)于轉(zhuǎn)移的糖部分的鍵 合的反相反應(yīng)機(jī)理（34)。EP 2 128 265 A1描述了真菌來源即來自木霉屬（Trichoderma) 的糖基轉(zhuǎn)移酶，用于糖基化黃酮類化合物。EP 1 985 704 A1公開了也作用于黃酮類化合 物的來自玫瑰植物的糖基轉(zhuǎn)移酶。迄今為止，已經(jīng)鑒定并且詳細(xì)表征了極少數(shù)的原核來源 的黃酮類化合物-作用GT1。目前已知的來源于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的接受黃酮化合物的UGT 都屬于甘露糖苷（macroside)糖基轉(zhuǎn)移酶（MGT)亞族，且來源于桿菌（Bacilli)和鏈霉菌 (Str印tomycetes) (35-37;另見 EP 1 867 729 A1 和 TO 2009/015268 A1)。此外，來源于 革蘭氏陰性黃單胞菌（Xanthomonas campestris)的單個(gè)黃酮類化合物作用UGT是已知的 (38) 〇 因此，仍需要用于修飾如黃酮類化合物、色酮類化合物等多酚的方法。因此，本發(fā) 明的一個(gè)目的是提供這樣的方法。該目的通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題來解決。本專利技術(shù)的有利 實(shí)施方案具體陳述在從屬權(quán)利要求中。 在第一方面，本專利技術(shù)提供了催化多酚，例如酚酸衍生物、查爾酮類化合物、色酮類 化合物、香豆素衍生物、黃酮類化合物和芪類化合物糖基化的酶，其中所述酶： a)包含SEQ ID NO :7-12的序列之一的氨基酸序列；或 b)由包含SEQIDN0 :1-6的序列之一的核苷酸序列的核酸編碼；或 C)與上述a)或b)限定的酶之一同源；或 d)由一個(gè)核酸編碼，所述核酸在嚴(yán)格條件下與互補(bǔ)于包含SEQ ID NO :1_6的序列 之一的核苷酸序列的序列的核酸雜交。 本文所描述的新酶表示為GtfC、MgtB、MgtC、MgtS、MgtT和Mgtw，其屬于GT 1家族 并且對(duì)黃酮類化合物和類似分子等這樣的多酚具有高度活性。 本文中的術(shù)語(yǔ)"包含"涵蓋術(shù)語(yǔ)"具有"，即不被解釋為：除了明確提及的要素外的 其它要素一定存在于實(shí)施方案中。例如，術(shù)語(yǔ)"包含SEQ ID NO :X的氨基酸序列的酶"也涵 蓋具有SEQ ID NO :X的氨基酸序列的酶，在這種語(yǔ)境中，"具有"意指僅由SEQ ID NO :X中 的氨基酸組成。 在提及核酸、蛋白或肽時(shí)本文所用的術(shù)語(yǔ)"同源性"是指，一個(gè)核酸與另一核酸在 其核苷酸序列上實(shí)質(zhì)相同或相似，或蛋白或肽與另一種蛋白或肽在其氨基酸序列上實(shí)質(zhì)相 同或相似，但與相比較的核酸或蛋白或肽并不完全相同。兩個(gè)核酸或蛋白或肽之間的同源 性的存在可以通過以下方式來確定：比較第一序列中的位置與第二序列中的對(duì)應(yīng)位置，從 而確定在該位置是否存在相同或相似的殘基。當(dāng)存在某一最小百分比的相同或相似的核 苷酸或氨基酸時(shí)，兩條比較的序列彼此同源。同一性表示在等同位置比較兩條序列時(shí)，存在 相同的核苷酸或氨基酸。任選地，可能有必要考慮序列空位以便產(chǎn)生可能的最佳比對(duì)。相 似的氨基酸是具有相同或同等化學(xué)和/或物理性質(zhì)的非相同氨基酸。用具有相同或同等 化學(xué)和/或物理性質(zhì)的另一氨基酸替換氨基酸被稱為"保守取代"。氨基酸的物理化學(xué)性 質(zhì)的實(shí)例是疏水性或電荷。就核酸而言，當(dāng)編碼序列中密碼子內(nèi)的一個(gè)核苷酸被替換為另 一核苷酸時(shí)，其稱為相似核苷酸或保守取代，新密碼子例如由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，仍然編 碼相同或相似的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉哪些核苷酸或氨基酸取代是保守取代。為 了確定兩個(gè)核酸之間的相似性或同一性程度，優(yōu)選采用最小長(zhǎng)度為60個(gè)核苷酸或堿基對(duì)， 優(yōu)選最小長(zhǎng)度為 70、80、90、100、110、120、140、160、180、200、250、300、350 或 400 個(gè)核苷酸 或堿基對(duì)，或各自核苷酸序列中至少25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 2%或99. 5%的核苷酸的長(zhǎng)度。對(duì)于蛋白 /肽，優(yōu)選采用最小長(zhǎng)度為20,優(yōu)選的最小長(zhǎng)度為25、30、35、40、45、50、60、80或100,更優(yōu) 選的最小長(zhǎng)度為120、140、160、180或200個(gè)氨基酸，或最小長(zhǎng)度為比較的各個(gè)氨基酸序列 的 25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99. 2%或99. 5%的氨基酸。特別優(yōu)選各個(gè)蛋白或核酸的全長(zhǎng)用于比較。兩條序 列的相似性或同一性程度可以例如通過使用計(jì)算機(jī)程序BLAST(19)使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測(cè)定，參 見例如http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/。同源性的確定依賴于比較的序列的長(zhǎng)度。 對(duì)于本專利技術(shù)的目的的兩個(gè)核酸，其中較短的核酸包含至少100個(gè)核苷酸，當(dāng)至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、至少99. 2%或99. 5%的核苷酸相同和/或相似（BLAST的"同一性（identities) "或 "相似性（positives)")，優(yōu)選是相同時(shí)，將被認(rèn)為是同源的。在序列長(zhǎng)度為50-99個(gè)核苷酸 的情況下，當(dāng)至少80%、優(yōu)選至少85%、86%、87%、88%、89%或90%的核苷酸相同和/本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
催化多酚糖基化的酶，其中所述酶：a)包含SEQ?ID?NO：7?12的序列之一的氨基酸序列；或b)由包含SEQ?ID?NO：1?6的序列之一的核苷酸序列的核酸編碼；或c)與上述a)或b)限定的酶之一同源；或d)由一個(gè)核酸編碼，所述核酸在嚴(yán)格條件下與互補(bǔ)于包含SEQ?ID?NO：1?6的序列之一的核苷酸序列的序列的核酸雜交。

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：烏利齊·亞堡思馳，沃爾夫崗·施特賴特，朱莉婭·朱根恩森，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：漢堡大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：德國(guó);DE