一種純化制備N-磺酰氨甲?；舅氐姆椒夹g

本發明專利技術提供了一種純化制備N-磺酰氨甲?；舅氐姆椒?。該方法包括產毒藻的培養、毒素的提取、毒素的收集與純化等步驟。此工藝簡單有效，同時制備得到的N-磺酰氨甲?；显宥舅?2(C1)和N-磺酰氨甲?；显宥舅?3(C2)純度可達到91％以上，可用于水產品中貝類毒素質量安全檢測及科學研究。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及微生物檢測領域，具體的說涉及一種純化制備N-磺酰氨甲?；舅?的方法。
技術介紹
麻痹性貝類毒素（PSTs)是水體中浮游藻類或微生物產生的一類水溶性極強 的小分子次生代謝產物。其基本結構是兩個胍基的四水化嘌呤多疊六元環。根據取代 基團的不同，主要分為四類：①氨基甲酸酯類毒素（Carbamatetoxins)，包括石房蛤毒 素（Saxitoxin，STX)、新石房蛤毒素（neoSTX，ΝΕ0)和膝溝藻毒素l_4(Gonyautoxins， GTX1-4);②N-磺酰氨甲酰基類毒素（N-sulfocarbamoyltoxins)，包括GTX5 (B1)、 GTX6(B2)和C1-C4 ;③脫氛甲醜基類毒素（Decarbamoyltoxins)，包括dcSTX、dcneoSTX、 dcGTXl-4;④脫氧脫氛甲醜基類毒素（Deoxydecarb-amoyltoxins)，包括doSTX、doneoSTX 和doGTXl等。PSTs是一類高效的鈉離子通道神經毒素。當人體攝入了被PSTs污染的海產品 后，臨床初期主要表現為嘴、唇、舌發麻，四肢出現麻痹癥狀，感覺出現異常，人變得虛弱和 混亂；后期主要表現為惡心，嘔吐，呼吸急促，頭痛發燒，吞咽困難，血壓異常，嚴重者出現意 識模糊甚至死亡。N-磺酰氨甲酰基類毒素雖然其本身毒性較小，但是在生物體內極易通過 生物轉化脫去磺酰基和氨基甲酸酯鏈生成毒性很強的STX和脫氨甲酰基類毒素。另外，最 新的生物轉化實驗也發現并確認了在貝類水產品體內存在C1/C2毒素。 為保障公眾不受PSTs的威脅，世界許多國家、地區及相關國際組織都已經對貝類 水產品進行嚴格管理和控制，并制定了相應的貝類水產品及其制品的PSTs限量標準。但 PSTs標準品價格昂貴，因此相關毒素標準品制備與純化技術受到尚度關注。 由于毒素來源的不穩定性，PSTs純化技術一直是該類毒素定量與定性分析的重 點和難點。目前PSTs純化的毒素主要來源是天然海域中分離純化得到的產毒藻株。但有 很大一部分藻株不具備培養條件，已有報道培養條件并能夠小規模化養殖的產毒藻種只有 A.catenella、A.tamarense(AT，塔瑪亞歷山大藻）和A.minutum等少數幾個。但是對產毒 藻AT的培養仍然沒有系統的、最佳的方法。 因此有必要建立了一種可以制備純化N-磺酰氨甲?；惗舅胤椒ǎ瑸橄嚓P水產 品質量安全監管提供技術支持。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種純化制備N-磺酰氨甲酰基毒素的方法，該方法包括 如下步驟： (1)產毒藻的培養：將AT的純藻株在無菌條件下接入含營養鹽的人工海水中，純 藻株液和人工海水體積比為1:2,在f/2培養基、溫度23°C、鹽度2. 8-3. 2% (優選的鹽度為 3. 0% )、pH7. 5-8. 5(優選的pH為8. 0)、光強160001ux和光暗比14L:10D的條件下進行 藻株的培養，培養時間5天； (2)毒素的提?。涸逡航?.22μπι濾膜抽濾，取膜上的藻體以體積比為1 :2加入提 取液，室溫提取兩次，每次10min，4500rpm離心lOmin后合并兩次提取液，-20°C冷凍4h棄 去上層乙腈層，即得到毒素的粗提液；其中提取液為乙腈、水和甲酸按照80 :19. 9 :0. 1的體 積比配制而成； ⑶毒素的收集與純化：取粗提液〇. 5mL進入GPC(G-15)純化系統，在0. 1%乙酸 為流動相的等度條件下洗脫，流速設為2. 50mL/min，設置流出液的收集時間，用自動收集器 收集；收集得到的流出液冷凍干燥至盡干并用〇. 1 %乙酸定容至lmL，過0. 22μm濾膜，進 LC-MS/MS對產毒種類進行定性；采用HPLC-FLD柱后衍生-峰面積歸一法計算毒素純度。 其中步驟（3)中所使用的液相分析條件具體如下： 色譜柱：TSK-gelAmide-80 親水柱（150X2mm，3ym);柱溫：30°C;流速：0· 3mL/ min;進樣量：5μL; 流動相：A相：乙腈；B相：3. 6mM甲酸、2mM甲酸銨水溶液（pH3. 5); 梯度洗脫程序：0min, 15%B;0-10min，45%B;10-llmin，45%B;ll-14min，15% B, 14-19,min15%B〇 步驟（3)中所使用的質譜分析條件具體如下： 離子源模式：正離子模式（ESI+);噴霧電壓：4.Okv(ESI+);加熱塊溫度：300°C;離 子傳輸管溫度：350°C;鞘氣：氮氣，流量35arb;輔助氣：氮氣，流量20arb;碰撞氣：氬氣，碰 撞壓力1. 5mTorr;毒素的質譜參數見表1。 步驟（3)中所使用色譜及衍生條件如下： 色譜柱：AgleaVenusilXBPC8 (4. 6X150mm，5μm);流動相（等度）：2mM四丁基 磷酸銨水溶液（10%乙酸或1 %氨水單向調節pH至5.8);流速：0. 8mL/min;柱后衍生劑： lOOmM磷酸+5mM高碘酸水溶液（5MNaOH調節pH至7. 8)，流速0. 4mL/min;酸化劑：0. 75M 硝酸，流速〇. 4mL/min;柱溫：20°C;衍生池溫度：85°C;熒光檢測器參數：激發波長：330nm; 發射波長：390nm;進樣量：10μL〇 本專利技術還提供了一種塔瑪亞歷山大藻的培養方法，將AT的純藻株在無菌條件下 接入含營養鹽的人工海水中，純藻株液和人工海水體積比為1:2,在f/2培養基、溫度23°C、 鹽度2.8-3.2%(優選的鹽度為3.0%)、？!17.5-8.5(優選的？!1為8.0)、光強1600011?和 光暗比14L:10D的條件下進行藻株的培養，培養時間5天。 本專利技術通過優化塔瑪亞歷山大藻的培養條件，使得其能夠保持最高活力進行增 殖，進而產生最大量的PSTs，此株藻種能產生C1/C2以及GTX2/GTX3四種PSTs的組分，其中C2含量最高，可達到90%以上；經葡聚糖凝膠G-15純化后，將C1/C2與GTX2/3完全分離； 通過調整收集時間可以得到純度在91%以上的C1/C2。此技術與現有技術相比，方法簡單， 毒素純度較高?！靖綀D說明】 圖1為毒素粗提液經葡聚糖凝膠G-15進行毒素純化的回收率。 圖2為毒素純化后的C1/C2HPLC-FLD色譜圖?！揪唧w實施方式】 下面給出的實施例對本專利技術作進一步的說明。本專利技術是結合最佳實施例進行描述 的，然而在閱讀本專利技術實例后，本領域技術人員能領會并在公開的實施中做許多改變也可 獲得相同或類似的結果，均屬于本專利技術的構思和范圍。更具體的說，有些試劑可替代本文所 公開的試劑而得到相同或類似結果。所有類似的取代或修飾均被認為本專利技術的構思和范 圍，所有上述等價形式均屬于本專利技術權利要求書限定的范圍。 實施例1 1、材料與方法 1. 1主要儀器與試劑LC-MS/MS:電噴霧離子源（ESI)(ThermoFisherScientific，USA);HPLC柱后熒光衍生系統：Watersalliance2690/2475 (Waters，USA);凝膠過濾系統：J2preplincGPC/SPE/evap聯用儀（J2scientific，USA); 培養箱：PQX_350H人工氣候本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種純化制備N?磺酰氨甲酰基毒素的方法，其特征在于該方法包括如下步驟：(1)產毒藻的培養：將AT的純藻株在無菌條件下接入含營養鹽的人工海水中，純藻株液和人工海水體積比為1:2，在f/2培養基、溫度23℃、鹽度2.8?3.2％、pH?7.5?8.5、光強16000lux和光暗比14L：10D的條件下進行藻株的培養，培養時間5天；(2)毒素的提取：藻液經0.22μm濾膜抽濾，取膜上的藻體以體積比為1：2加入提取液，室溫提取兩次，每次10min，4500rpm離心10min后合并兩次提取液，?20℃冷凍后棄去上層乙腈層，即得到毒素的粗提液；其中提取液為乙腈、水和甲酸按照80：19.9：0.1的體積比配制而成；(3)毒素的收集與純化：取粗提液進入G?15純化系統，在0.1％乙酸為流動相的等度條件下洗脫，流速設為2.50mL/min，設置流出液的收集時間，用自動收集器收集；收集得到的流出液冷凍干燥至盡干并用0.1％乙酸定容，過0.22μm濾膜，進LC?MS/MS對產毒種類進行定性；采用HPLC?FLD柱后衍生?峰面積歸一法計算毒素純度。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊憲立，周磊，聶冬霞，趙志勇，武愛波，
申請(專利權)人：上海市農業科學院，上海科立特農產品檢測技術服務有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31