經修飾的ACE2多肽制造技術

本發明專利技術涉及經修飾的血管緊張素轉換酶2（ACE2）多肽及其藥物和分析用途。特別地，本發明專利技術涉及Zn2+耗盡、不含Zn2+、混合金屬和金屬離子取代的ACE2，以及用于制造這些變體的方法及其用途，例如這些ACE2變體的治療和分析用途。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】經修飾的ACE2多肽 專利
本專利技術涉及經修飾的血管緊張素轉換酶2 (ACE2)變體及其藥物和分析用途。特 別地，本專利技術涉及Zn2+耗盡、不含Zn2+、混合金屬和金屬離子取代的ACE2,以及用于制造這些 變體的方法及其用途，例如這些ACE2變體的治療和分析用途。 專利技術背景 ACE2 (血管緊張素轉換酶2,也稱為血管緊張素轉換酶相關羧肽酶；酶學委員會編號： 3. 4. 17. 23)是腎素血管緊張素系統（RAS)的關鍵金屬蛋白酶，參見Donoghue等人，Circ. Res. 87,2002:el-e9;Tipnis等人，J.Biol.Chem·，275(43)，2000,33238-43)。ACE2最 初鑒定為ACE類似物。Tipnis等人描述了來自CH0細胞的ACE2 (在所述情況下仍被稱為 ACEH)分尚及其cDNA分尚。ACE和ACE2兩者均為在中心處具有催化鋅原子的金屬蛋白酶。ACE和ACE2隨后 發現在活性以及機制方面是不同的。ACE增加血壓，而ACE2降低血壓。在機制上，ACE是肽 基二肽酶，而ACE2 是羧肽酶（Towler等人，J.BiolChem279,2004,17996-18007)。ACE2主要作為膜錨定的鋅金屬蛋白酶存在，其在血液循環中起作用，并且誘導受 累器官中的局部效應，以及經由血液循環的全身效應。ACE2在脈管系統以及大多數器官 中表達，但占優勢地在腎、肝、心臟、肺和睪丸中表達。它作為單肽酶切割，從而使多種底 物活化或失活，所述底物包括RAS的肽，例如血管緊張素II(AngII)，其被切割為血管緊 張素1-7 (Angl-7)，以及血管緊張素I(AngI)，其被切割為血管緊張素1-9 (Angl-9)， 以及Apelin、強啡肽原、去-Arg-緩激肽及其他（Vickers，C.等人，J.Biol.Chem.，277， 2002,14838-14843)。ACE2作為針對ACE-AngII-AL受體軸的反調節劑在RAS內起關鍵 作用。ACE2通過從由血管緊張素II介導的促炎、高血壓、增殖和血管收縮軸轉變為反調 節軸而起作用，所述反調節軸通過經由ACE2切割AngII生成Ang1-7 (Danilczyk，U. & Penninger，Circ.Res·，98, 2006,463-471 ;Vickers，C.等人，J.Biol.Chem.，277, 2002， 14838-14843)，以及更少程度地，通過ACE2切割AngI生成Ang1-9而觸發。ACE2視為重要 的穩態調節物（Ferrario，C.M·，等人，J.Am.Soc.N印Ι?ΓοΙ.,ΙΙΘΘδ,ΠΙΘ-Ι?ΖΖΧΑΟΕ〗的 催化活性對于Angll比Angl高大約 400 倍（Vickers，C.等人，J.Biol.Chem.，277,2002， 14838-14843)。可溶形式的ACE2也在循環中發現，其缺乏跨膜結構域。這種可溶形式比膜 結合形式更適合用作廣泛多樣的治療方法中的活性化合物。 可溶和重組形式的ACE2已得到開發，以治療危害生命的疾病，例如急性肺和心臟 狀況，以及纖維化和腫瘤學疾病。ACE2作為ACE2反調節劑的功能首先在國際專利申請公開號W02004/000367中 報道。該申請公開了各種疾病的治療處理，例如高血壓、充血性心臟衰竭、慢性心臟衰竭、 急性心臟衰竭、心肌梗塞、動脈硬化和腎功能衰竭、以及肺疾病包括成人呼吸窘迫綜合征 (ARDS)。 國際專利申請公開號W02004/023270描述了ACE2的結晶化。 國際專利申請公開號W02008/151347和美國專利申請公開號US2010/310546描述 了ACE2糖基化和ACE2二聚體。 測定ACE2活性的方法例如在國際專利申請公開號W0 2008/046125A和美國專利 申請公開號US2010/0261214中描述。 國際專利申請公開號W02009/086572描述了ACE2在治療肝疾病特別是炎性肝疾 病和纖維化中的用途。 國際專利申請公開號W02009/076694描述了使用ACE2的免疫療法。 國際專利申請公開號W02009/124330描述了使用ACE2治療各種腫瘤。ACE2描述為含鋅金屬蛋白酶，所謂的鋅蛋白酶。用于臨床使用的目前完全活性的 制劑含有等摩爾鋅/蛋白質比。鋅由此在酶的活性中心絡合。藥物產品制劑通常補充有 ZnCl2，以通過抑制酶結合的鋅的喪失來穩定酶促活性。 專利技術概述 根據第一個實施方案，提供了在活性位點具有耗盡水平的Zn2+的血管緊張素轉換酶2 (ACE2)多肽群體。 根據本專利技術的第一個方面，提供了ACE2多肽群體，其中活性位點基本上不含任何 金屬離子。 根據本專利技術的第二個方面，提供了ACE2多肽群體，其中活性位點由選自下述的過 渡金屬離子或后過渡金屬離子占據：Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Pb2+Al、Ga、In、 Sn、Tl、Pb、Bi和Po,優選Co2+、Zn2+、Ni2+、Pb2+、Al3+、Al2+和Sn2+，例如Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+和 Al3+〇 根據本專利技術的第三個方面，提供了ACE2多肽群體，其中未由鋅占據的活性位點由 選自下述的一種或多種過渡金屬離子或后過渡金屬離子占據：Co2+、Ni2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、 卩〇3+、卩62+、卩13 2+八1、63、111、511、1'1、？13、81和？〇，優選(：〇2+、2112+、附 2+、？132+、八13+、八12+和5112+， 例如Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+和A1 3+。 根據第二個實施方案，提供了ACE2多肽群體切割溶液中的ACE2底物的用途。 根據第三個實施方案，提供了用于制備ACE2多肽群體的方法，其包括下述步驟： a. 在細胞系統中表達ACE2多肽； b. 分離所表達的多肽； c. 通過添加金屬螯合劑去除在活性位點中結合的金屬離子中的一些或全部。 根據第四個實施方案，提供了包含ACE2多肽群體和藥學可接受的載體或賦形劑 的藥物組合物。 根據第五個實施方案，提供了用于療法中的ACE2多肽群體。 根據第六個實施方案，提供了用于治療或預防選自下述的疾病的ACE2多肽群體： 高血壓(包括血壓升高)、充血性心臟衰竭、慢性心臟衰竭、急性心臟衰竭、收縮性心臟衰竭、 心肌梗塞、動脈硬化、腎衰竭、腎功能衰竭、以及肺疾病例如成人呼吸窘迫綜合征（ARDS)、急 性肺損傷（ALI)、慢性阻塞性肺疾?。–0PD)、肺動脈高血壓、腎纖維化、慢性腎功能衰竭、急 性腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭、急性腎損傷和多器官功能障礙綜合征。 根據第六個實施方案，提供了ACE2多肽群體在制造用于治療或預防選自下述的 疾病的藥劑中的用途：高血壓(包括血壓升高)、充血性心臟衰竭、慢性心臟衰竭、急性心臟 衰竭、收縮性心臟衰竭、心肌梗塞、動脈硬化、腎衰竭、腎功能衰竭、以及肺疾病例如成人呼 吸窘迫綜合征（ARDS)、急性肺損傷（ALI)、慢性阻塞性肺疾?。–OPD)、肺動脈高血壓、腎纖 維化、慢性腎功能衰竭、急性腎功能衰竭、慢性腎功能衰竭、急性腎損傷和多器官功能障礙 綜合征。 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種血管緊張素轉換酶2（ACE2）多肽群體，其在活性位點中具有耗盡水平的Zn2+。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：H洛伊布納，B佩巴爾，M舒斯特，S施特蘭納，
申請(專利權)人：阿派隆生物制劑股份公司，
類型：發明
國別省市：奧地利;AT