本發(fā)明專利技術(shù)公開一種靶向性沉默RhoB的shRNA序列、引物、應(yīng)用、shRNA慢病毒載體及構(gòu)建方法，本發(fā)明專利技術(shù)針對Rho激酶信號通路的關(guān)鍵因子RhoB設(shè)計了shRNA序列，并構(gòu)建了相應(yīng)的shRNA慢病毒沉默載體。所述shRNA序列包含序列5’-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3’。通過實驗結(jié)果證實本發(fā)明專利技術(shù)的shRNA能夠顯著沉默RhoB的表達(dá)。鑒于RhoB作為一種潛在的肺動脈高壓治療靶點，因此本發(fā)明專利技術(shù)的提供的RhoB的shRNA及其相關(guān)生物試劑，可用于研究和制備治療肺動脈高壓的相關(guān)疾病的藥物。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)設(shè)及分子生物學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，主要設(shè)及一種祀向性沉默化oB的ShRNA 序列、引物、應(yīng)用、ShRNA慢病毒載體及構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
RNA干擾（RNAinterference,RNAi)是一種在進(jìn)化上保守的基因防御機制，即一 種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTG巧。近年 來，RNAi技術(shù)的發(fā)展不僅大大推進(jìn)了人類后基因組計劃，還能應(yīng)用于高通量篩選藥物祀基 因，促進(jìn)基因治療和新藥開發(fā)，為治療癌癥、遺傳病等疾病開辟新途徑。在過去的幾年時間 里，RNAi技術(shù)作為一種新基因療法，已被廣泛用于疾病的基因治療研究領(lǐng)域，例如老年視黃 斑退化、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。另外，在帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病W 及腫瘤疾病等方面的治療研究，也已經(jīng)取得了有效成果。相比其它治療手段，RNAi技術(shù)對 致病基因的祀向性更強，毒副作用更低，因此開發(fā)更多的針對癌癥的RNA干擾片段具有十 分重要的意義。 肺動脈高壓（pulmonaryarteiThypertension,PAH)是由不同病因?qū)е碌腤肺 血管阻力和肺動脈壓力升高為特征的致命性疾病，素有"屯、血管系統(tǒng)的惡性腫瘤"之稱。目 前可行的治療方法有限、昂貴并伴有明顯的副作用。臨床數(shù)據(jù)根據(jù)表明，化0激酶活性在肺 動脈高壓（pulmonaryarte巧hypertension,PAH)患者中明顯增高，且與PAH的嚴(yán)重性及 持續(xù)時間相關(guān)。由此可見，化〇/化〇激酶信號通路在PAH形成中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)， 化〇/化〇激酶信號通路的異常活化，與血管疫李、動脈硬化、屯、力衰竭、屯、肌梗死、高血壓及 屯、絞痛等屯、血管疾病的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切，因此該信號通路可W作為屯、血管疾病治療的 突破口。動物及臨床試驗發(fā)現(xiàn)，使用通過抑制化〇/化0激酶信號通路的關(guān)鍵因子，可W有效 降低肺動脈壓力，改善右屯、室肥厚指數(shù)，抑制PAH的發(fā)展。 目前只有鹽酸法舒地爾作為化0激酶抑制劑上市應(yīng)用于臨床，但臨床應(yīng)用化〇激 酶抑制劑存在很多潛在的不良反應(yīng)，原因主要有擊ho激酶在組織細(xì)胞中廣泛分布，并且抑 制不同組織細(xì)胞的化0激酶會產(chǎn)生不同的生理作用；現(xiàn)有的化0激酶抑制劑在抑制化0激 酶同時，對其他蛋白激酶也有抑制作用。 因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展，需研發(fā)出效果更好的化0激酶抑制劑，提高 其對化0激酶的專屬性和對不同組織細(xì)胞的選擇性。
技術(shù)實現(xiàn)思路
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供一種祀向性沉默化oB的ShRNA 序列、引物、應(yīng)用、shRNA慢病毒載體及構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有化0激酶抑制劑對化0激酶 的專屬性和對不同組織細(xì)胞的選擇性不夠好的問題。 本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下： 一種祀向性沉默化oB的shRNA序列，其中，包含針對化oB基因（GeneID:388)設(shè) 計的siRNA，其對應(yīng)的祀位點序列：5'-CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3'。 一種用于制備如上所述的shRNA序列的引物，其中，引物序列如下： 上游引物序列sh化oB-Pl:5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3' ； 下游引物序列sh化0B-P2 :5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3' 。 陽01引一種shRNA慢病毒載體，其中，所述shRNA慢病毒載體用于表達(dá)如上所 述的shRNA序列，所述shRNA慢病毒載體包含沉默目的基因化oB的祀位點序列 5' -CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT-3'。 陽01引所述的shRNA慢病毒載體，其中，所述shRNA慢病毒載體中包含采用W下引物退火 合成得到的sh化oB序列；引物序列如下：上游引物序列sh化oB-P1 :5'-ACCGCGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3' ； 下游引物序列sh化0B-P2 :5'-AAAACGTGTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTA CTGAACACG-3' 。 一種如上所述的ShRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其中，包括W下步驟： 采用引物退火合成shRNA序列；其中，上游引物序列sh化oB-Pl:5'-ACCGCGTGTTCA GTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3' ；下游引物序列sh化0B-P2 :5'-AAAACGT GTTCAGTAAGGACGAGTTCTCGAGAACTCGTCCTTACTGAACACG-3'； 陽01引將合成的shRNA序列連接到shRNA慢病毒載體上； 轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞St油le3,涂LB-Amp平板培養(yǎng)過夜，隨機挑取一個單克 隆進(jìn)行測序驗證，構(gòu)建得到用于表達(dá)祀向性沉默化oB的shRNA序列的shRNA慢病毒載體。 所述的shRNA慢病毒載體的構(gòu)建方法，其中，將合成的shRNA序列連接到shRNA慢 病毒載體上的過程包括W下步驟： WpCDFl-MCS2-EFl-copGFP載體為模板，PCR擴增得到EFl-copGFP片段，用Mlul 和Afel雙酶切PCR產(chǎn)物，插入到同樣經(jīng)過Mlul和Afel雙酶切的慢病毒載體pLVX-Puro上， 得到載體骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro; 用Clal和化〇1雙酶切載體骨架pLVX-EFl-copGFP-PGK-Puro,去憐酸后電泳回收； 用Clal和化〇1雙酶切U6啟動子，與酶切后的載體pLVX-EFl-copGFP-Puro連接； 陽02引 PCR擴增大腸桿菌CC地致死基因，用化〇1和MluI雙酶切后，與經(jīng)過化〇1和Mlu I雙酶切的pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro載體連接，得到用于表達(dá)sh化oB的shRNA慢病 毒載體PLVX-U6-CC地-EFl-copGFP-PGK-Puro;用BsmBI單酶切shRNA慢病毒載體pLVX-Ue-cc地-EFl-copGFP-PGK-Puro,將退火 合成的sh化oB序列與pLVX-U6-EFl-copGFP-PGK-Puro載體骨架通過相應(yīng)的酶切位點連接。 一種如上所述的祀向性沉默化oB的shRNA序列的應(yīng)用，其中，將所述shRNA序列 用于制備抑制化oB基因表達(dá)的生物制劑。 所述的祀向性沉默化oB的shRNA序列的應(yīng)用，其中，所述shRNA序列用于制備治 療肺動脈高壓的藥物。 有益效果：本專利技術(shù)針對化ο激酶信號通路的關(guān)鍵因子化oB設(shè)計了shRNA序列，并 構(gòu)建了相應(yīng)的shRNA慢病毒沉默載體。通過實驗結(jié)果證實本專利技術(shù)的shRNA能夠顯著沉默 化oB的表達(dá)。鑒于化oB作為一種潛在的肺動脈高壓治療祀點，因此本專利技術(shù)的提供的化oB的 ShRNA及其相關(guān)生物試劑，可用于研究和制備治療肺動脈高壓的相關(guān)疾病的藥物。同時，本 專利技術(shù)證實抑制化oB基因表達(dá)可抑制人肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMC)的異常增殖和遷移，證明 化oB是一種潛在的治療肺動脈高壓的新型祀點，有利于進(jìn)一步研究由化〇/化〇激酶信號通 路本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種靶向性沉默RhoB的shRNA序列，其特征在于，其中包含用于沉默目的基因RhoB的靶位點序列5’?CGTGTTCAGTAAGGACGAGTT?3’。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：茍德明，康康，李潔璇，黃煉，張利敏，牛燕琴，姚麗君，吳伊可，
申請(專利權(quán))人：深圳大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：廣東;44
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