一種產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶微生物及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種能降解黃曲霉毒素B1（AFB1）的微生物夏孢生枝孢Cladosporium?uredinicolaHSK8。該微生物已于2015年3月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC?NO:M?2015181。不僅如此，該株菌還能利用工農(nóng)副產(chǎn)物或廢棄物糖蜜、玉米芯粉和橙皮粉發(fā)酵產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶，因此也大大節(jié)約了成本。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于微生物
，內(nèi)容為一株能有效降解黃曲霉毒素Bl(AFBl)的菌株夏抱生枝抱iCladosporium uredinicola HSK8)及其應(yīng)用。技術(shù)背景黃曲霉毒素B1于1960年被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)時(shí)，在英國就是因?yàn)槲故沉撕S曲霉毒素的花生柏，導(dǎo)致了大批火雞暴斃。自那以后已有20多種黃曲霉毒素被分離，目前已經(jīng)有18種被鑒定，其中最為常見的幾種常見的是B2、Gp G2、MJPM2。B類黃曲霉毒素的命名源于其在紫外光下可發(fā)出藍(lán)色(blue)熒光，類似的，G類黃曲霉毒素則能在紫外光下發(fā)出綠色(green)焚光，黃曲霉毒素M1、M2因其最先發(fā)現(xiàn)于牛奶(milk)中所以被這樣命名。在各黃曲霉毒素中，數(shù)黃曲霉毒素Bl(AFBl)毒性最強(qiáng)。AFB1每年造成大量的糧食污染，并且對(duì)人畜的健康。黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是寄生曲霉{Aspergillus parasiticus)和黃曲霉{Aspergillus flavus)的典型次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有極強(qiáng)的毒性、致癌性和致畸性。除上述兩種曲霉外，A nominus, A.tamarii取A/wei/ob iaazarii也報(bào)道具有合成黃曲霉毒素的能力，但以寄生曲霉和黃曲霉為主。食米儲(chǔ)存不當(dāng)，極容易發(fā)霉變黃，產(chǎn)生黃曲霉毒素。生物法去除AFB1使得去除食品、飼料中的AFB1可在溫和的條件下進(jìn)行，而同時(shí)又不影響食品和飼料中的營養(yǎng)，與化學(xué)法和物理法相比，這是生物法的優(yōu)點(diǎn)。化學(xué)法和物理法的主要缺點(diǎn)在于要么反應(yīng)條件過于激烈、脫毒效果不理想，要么耗資大、破壞營養(yǎng)成分及適口性，因?yàn)檫@些原因，這兩類方法難以得到廣泛應(yīng)用。用生物法來去除AFB1自AFB1被發(fā)現(xiàn)初就有研究。生物法基于微生物對(duì)真菌毒素或產(chǎn)毒真菌的作用，這些微生物包括酵母、絲狀真菌、細(xì)菌、藻類等，作用機(jī)制包括營養(yǎng)和空間競(jìng)爭、反應(yīng)、抗生等。國內(nèi)報(bào)道的降解AFB1的微生物有:假蜜環(huán)菌{Armillariella tabescens)、施氏假單胞菌{Pseudomonas s tu tzeri)、嗜麥芽窄食單胞菌{stenotrophomonas sp.)等；國外報(bào)道的有 Dactylium dendroides NRRL2575、Corynebac terium rubrum、Aspergillus niger、Trichoderma viride、Mu cor ambiguus、惡臭假單胞菌(Pseudomonas /wiii/a)、紅蹄紅球菌 U^hodococcus、澄色黃桿菌{Flavobacterium aurantiacum)等。除此之外，近年來還出現(xiàn)了有關(guān)藥用植物降解黃曲霉毒素的文獻(xiàn)報(bào)道，比如-.Adhatoda vasica Nees, zimmu, Trachyspermum ammi (L.)Sprague ex Turrill。關(guān)于生物降解AFB1的文獻(xiàn)報(bào)道越來越多，這說明生物法降解AFB的研究正蓬勃發(fā)展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)黃曲霉毒素解毒酶的菌株及其應(yīng)用，有效解決黃曲霉毒素污染的問題。不僅如此，該株菌還能利用工農(nóng)副產(chǎn)物或廢棄物糖蜜、玉米芯粉和橙皮粉發(fā)酵產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶，因此也大大節(jié)約了成本。為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)，專利技術(shù)人通過大量試驗(yàn)反復(fù)進(jìn)行菌種篩選研究，終于獲得了一株合成黃曲霉毒素解毒酶能力較強(qiáng)的霉菌:夏孢生枝孢Cladosporium uredinicola HSK8，已于2015年3月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M 2015181，地址為中國武漢武漢大學(xué)。形態(tài)學(xué)特征:菌落粉狀，反面黑綠色；分生孢子頂生或側(cè)生，形成分枝的孢子鏈，橢圓形，淡橄欖綠色。代謝特性:代謝過程能產(chǎn)生黃曲霉毒素解毒酶；較強(qiáng)的纖維素、半纖維素利用能力。本專利技術(shù)涉及的高產(chǎn)黃曲霉毒素解毒酶的夏孢生枝孢Cladosporium uredinicolaHSK8是按照如下方法獲得的: (1)產(chǎn)黃曲霉毒素降解酶菌株的篩選 取5g采集的花生殼樣品置于50ml滅菌生理鹽水中，37°C、160r/min條件下振蕩2h。然后取5ml菌液接種于富集培養(yǎng)基(富集培養(yǎng)基配方(g/L):香豆素1，(NH4)2S04 5，NaCl 8.5，0.1MPa滅菌20min)中，37°C、160r/min條件下培養(yǎng)24h。連續(xù)富集培養(yǎng)3次。取富集培養(yǎng)液稀釋成不同不同稀釋倍數(shù)的菌液，然后涂布于初篩平板(初篩平板培養(yǎng)基配方(g/L):香豆素 1，(NH4)2S04 5，KH2P04 2.5，MgS04 l，NaH2P04.12H 20 0.5，F(xiàn)eS04.7H 20 0.1，CaCl20.1，瓊脂20，0.1MPa滅菌20min)上，30°C恒溫培養(yǎng)7d。取稀釋涂布平板上長勢(shì)較好的三株霉菌保存于試管斜面(斜面培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，115°C滅菌30min)，保藏備用。通過搖瓶發(fā)酵(發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30，NaN03 2.0，Κ2ΗΡ04.3Η20 1.0,KC1 0.5，MgS04 0.5，F(xiàn)eS04.7H20 0.01，0.1MPa 滅菌 20min)，培養(yǎng) 48h 后取樣品進(jìn)行 AFB1 降解率測(cè)定。通過計(jì)算，初篩得到的三株霉菌中，夏孢生枝孢(Cladosporiwn uredinicolaHSK8)對(duì)AFB1的降解能力最強(qiáng)40.68%，該菌在中國典型微生物保藏中心的專利保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2015181。故選用 CCTCC NO:M 2015181 作為下一步實(shí)驗(yàn)菌株。(2) CCTCC NO:M 2015181 發(fā)酵條件的優(yōu)化 采用單因素試驗(yàn)考察CCTCC NO:M 2015181的發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵周期、接種量、裝液量對(duì)木聚糖酶產(chǎn)量的影響。發(fā)酵培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基(蔗糖30g/L，NaN03 2.0g/L，Κ2ΗΡ04.3H20 1.0g/L，KC10.5g/L，MgS04 0.5g/L，F(xiàn)eS04.7H20 0.01g/L，0.1MPa 滅菌 20min)。初始發(fā)酵條件為:白然pH,接種量 10%，裝液量 50 ml/250 ml，28 °C，180r/min 搖瓶發(fā)酵 48h。a.發(fā)酵溫度對(duì)AFB1降解率的影響 以10%的接種量將Cladosporium uredinicola HSK8種子液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于 25，28，31，34，37，40° C 進(jìn)行培養(yǎng) 48h。轉(zhuǎn)速 180r/min，裝液量 50mL/250mL。以此研究發(fā)酵溫度對(duì)AFB1降解率的影響。b.裝液量對(duì)AFB1降解率的影響 以10%的接種量將種子轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中28。C、180 r/min條件下培養(yǎng)48h，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量梯度為(mL/250mL):25，50，75，100，125。以此研究裝液量對(duì)AFB1降解率的影響。c.接種量對(duì)AFB1降解率的影響接種量(v/v)梯度分別為:1%，3%，6%，9%，12%，15%。通過此接種量的不同來研究接種量對(duì)AFB1降解率的影響。發(fā)酵溫度28° C，轉(zhuǎn)180r/min，裝液75 mL/250mL，培養(yǎng)時(shí)間48h。d.發(fā)酵周期對(duì)AFB1降解率的影響 在最優(yōu)發(fā)酵條件下，分別本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶微生物為夏孢生枝孢Cladosporium?uredinicola?HSK8，其保藏編號(hào)為CCTCC?NO:?M?2015181。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔡俊，邵帥，王常高，杜馨，林建國，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：湖北工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：湖北;42