用于克隆和操作基因組的方法技術

本文公開了用于在異源宿主細胞中克隆供體基因組的組合物和方法。在一種實施方式中，供體基因組可在宿主細胞中被進一步修飾。修飾的或未修飾的基因組可進一步從宿主細胞分離并轉移到受體細胞。本文公開的方法可用于在更加容易處理的宿主細胞中改變來自難處理供體細胞的基因組。

【技術實現步驟摘要】
本申請是分案申請，原申請的申請日為2010年3月5日、申請號為201080020174.4(PCT/US2010/026434)、專利技術名稱為“用于克隆和操作基因組的方法”。相關申請的交叉引用本申請要求于2009年3月6日提交的題目為“用于克隆和操作基因組的方法（MethodsforCloningandManupulatingGenomes）”的美國臨時申請號61/158,320的權益，其通過引用以其整體并入本文。本申請與Gibson等于2008年10月7日提交的美國申請號12/247,126相關，美國申請號12/247,126要求于2007年10月8日提交的美國臨時申請60/978,388；于2007年10月29日提交的美國臨時申請60/983,549；于2008年1月23日提交的美國臨時申請61/062,214；于2008年1月24日提交的美國臨時申請61/023,392和于2008年9月11日提交的美國臨時申請61/096,270的權益，其每一篇通過引用以其整體并入本文。序列表的并入本申請包含對氨基酸序列和/或核酸序列的引用，其與本申請同時經由EFS-Web提交，如在MPEP§1730II.B.2(a)(C)中授權并闡明的，序列表文本文件為“616872004140.txt”，文件大小106,298字節，于2010年3月3日創建。上述序列表依照37C.F.R.§1.52(e)(5)通過引用以其整體由此并入。背景技術使用具有高等遺傳系統的生物作為從許多物種中分離的核酸分子的宿主允許在宿主中操作分離的核酸序列。但是，由于對可轉移入具有易處理遺傳學的物種比如酵母中的核酸分子大小的限制，在外源宿主中通過克隆和修飾染色體和基因組改造生物的能力受到限制。盡管更大的核酸(例如，DNA)已經被轉移入宿主細胞，但是通過常規方法克隆的核酸通常包括僅僅少數基因。例如，16kb小鼠線粒體基因組已被克隆入大腸桿菌(Itaya等,NatMethods5,41(2008);Yoon和Koob,NucleicAcidsRes31,1407(2003))、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)(Itaya等,NatMethods5,41(2008);Yoon和Koob,NucleicAcidsRes31,1407(2003))和酵母(Wheeler等,Gene198,203(1997))中。139kb玉米葉綠體基因組已被克隆入酵母(Gupta和Hoo,PlantMoIBiol17,361(1991)中，和135kb水稻葉綠體基因組已被克隆入枯草芽胞桿菌(B.subtilis)(Itaya等,NatMethods5,41(2008))中。1.8Mb流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)基因組的大約10%已作為附加型元件(episomalelement)克隆入大腸桿菌(Smailus等,SystSynthBiol;1,139(2007))中。3.5Mb集胞藻屬(Synechocystis)PCC6803基因組被插入枯草芽胞桿菌基因組的三個非連續區域，除了兩個核糖體RNA操縱子(Itaya等,PNASUSA102,15971(2005))。完全合成的0.6Mb生殖器支原體(Mycoplasmagenitalium)基因組已被作為環形酵母著絲粒質粒(YCp)裝配入酵母(Gibson等,Science319,1215(2008);Gibson等,PNASUSA,105(51):20404-9(2008))。美國專利號6,670,154描述了通過融合細菌與酵母——使修飾的基因組線性化，使修飾的細菌基因組轉化為人工酵母染色體的方法。美國專利申請公開號2005/0019924描述了用于將原核基因組作為環形分子引入真核細胞并轉化為人工染色體的核酸和方法。WO02/057437描述了包含巨細胞病毒(CMV)基因組的YAC載體。美國專利號7,083,971描述了用于克隆、操作和輸送大核酸片段的重組方法和系統。美國專利申請公開號2005/0003511和Bradshaw等,NucleicAcidsResearch,23,4850-56(1995)描述了用于通過同源重組克隆大DNA區域的酵母-細菌穿梭載體。但是，所公開的克隆和操作方法受可轉移入宿主細胞中的供體核酸大小的限制，且不能提供操作和/或轉移在宿主細胞中增殖的核酸分子返回至與供體相關的受體細胞中，它們也不能解決克隆使用的不同細胞類型與外來核酸之間的不相容問題。需要另外的方法用于克隆大的核酸比如染色體或基因組入替代異源宿主、用于在替代宿主中操作大核酸的序列和用于轉移操作的基因組返回至與供體生物相似的受體生物，例如相同屬生物(例如，從原核到真核細胞并返回)。至今，在不同種或不同屬生物之間轉移大的核酸比如染色體和基因組的障礙仍未克服。例如種之間核酸的轉移可對宿主、供體和/或受體細胞具有毒性。在不同種、屬或群的生物中和從原核細胞到真核細胞并返回的核酸操作和增殖還可造成核酸的不穩定性并抑制它們的活化，比如來自核酸的基因的表達。
技術實現思路
本文提供了用于將供體核酸轉移(克隆)入宿主細胞；用于操作(例如，修飾)供體核酸，例如在宿主細胞中；用于將修飾的供體核酸移植入受體細胞的方法、核酸和系統。所提供的方法和其他組合物在整個生物學分科的核酸轉移和操作中是有用的，比如用于在真核宿主細胞中操作原核核酸和移植核酸返回原核受體。方法可用于通過轉移入具有強的良好表征的遺傳系統比如酵母中，操作具有弱遺傳系統的生物的供體核酸。因此，該方法、核酸和系統可用于修飾難處理的生物的核酸并操作和改造包括基因組在內的大核酸，例如產生合成基因組和細胞，比如之前在實驗室或自然中不存在的細胞和基因組。提供的方法可用于克隆、修飾并移植大于300千堿基(kb)的核酸和基因組，比如基因組，包括全基因組和至少最小基因組和細胞、病毒和細胞器基因組。從而供體基因組可在宿主細胞中被修飾以產生修飾的供體基因組，其賦予天然供體基因組否則不會展示的一種或多種表型。當這些修飾的供體基因組在擁有供體基因組的原始細胞類型中難以產生時，或當合成基因組可在宿主細胞中快速裝配并修飾，然后使修飾的基因組移植返回原始期望的細胞類型中用于產生感興趣的表型或產品時，該方法尤其有利。本申請中鑒定和描述的組合物和方法允許將核酸分子和基因組從難處理的供體細胞轉移入宿主細胞的新方法，在該宿主細胞中它們可被修飾以改變基因型并從而改變表型本文檔來自技高網...

【技術保護點】
用于制造細胞的方法，所述細胞展示由供體基因組編碼的表型，所述方法包括：(a)將所述供體基因組和適合在異源宿主細胞中克隆所述供體基因組的宿主載體引入所述異源宿主細胞，這樣獲得包含所述供體基因組的產物，所述供體基因組包含所述宿主載體，其中所述供體基因組是基本上完整的細胞、病毒或細胞器基因組，其至少是最小基因組，且長度大于大約300kb并包含核酸物質的最小組分，所述最小組分對于所述受體細胞展示由所述供體基因組編碼的表型是必需的；(b)從所述宿主細胞回收在步驟(a)中獲得的所述包含供體基因組的產物，所述供體基因組包含所述宿主載體；(c)在一定條件下，將(b)的所述產物引入受體細胞，以便所述受體細胞展示由所述產物編碼的表型；和(d)回收從步驟(c)得到的細胞。

【技術特征摘要】
2009.03.06 US 61/158,3201.用于制造細胞的方法，所述細胞展示由供體基因組編碼的表型，所述方法
包括：
(a)將所述供體基因組和適合在異源宿主細胞中克隆所述供體基因組的宿主
載體引入所述異源宿主細胞，這樣獲得包含所述供體基因組的產物，所述供體基
因組包含所述宿主載體，其中所述供體基因組是基本上完整的細胞、病毒或細胞
器基因組，其至少是最小基因組，且長度大于大約300kb并包含核酸物質的最小
組分，所述最小組分對于所述受體細胞展示由所述供體基因組編碼的表型是必需
的；
(b)從所...

【專利技術屬性】
技術研發人員：格威內德·A·本德斯，J·I·格拉斯，C·A·胡赤森，卡羅爾·拉蒂格，桑杰伊·瓦希，M·A·奧吉拉，漢密爾頓·O·史密斯，C·E·瑪麗曼，V·N·諾斯寇夫，RY·闖，D·G·吉布森，J·C·文特爾，
申請(專利權)人：合成基因組股份有限公司，
類型：發明
國別省市：美國;US