一種檢測山羊DQA1基因外顯子4的單核苷酸多態性的引物及方法技術

本發明專利技術公開了一種檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的引物及方法，引物由上游引物和下游引物組成，檢測時以山羊基因組DNA為模板，利用上、下游引物進行PCR反應擴增目的片段，用變性劑處理PCR產物，對變性后的擴增片段進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，應用銀染法染膠，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果即可判定山羊DQA1基因外顯子4的等位基因。通過本發明專利技術設計的核苷酸引物以及建立的檢測體系，可較為準確、快捷的擴增群體中不同等位基因型，可以準確的分析得到山羊DQA1基因外顯子4的不同單核苷酸突變位點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子遺傳學領域，涉及山羊分子標記輔助育種技術，具體涉及一種檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的引物及方法。
技術介紹
山羊DQA1基因位于MHCⅡ類基因的DQ亞區，具有豐富的多態性。MHC?(主要組織相容性復合體，major?histocompatibility?complex)，是脊椎動物中一個與免疫相關的多基因家族，具有共顯性、連鎖不平衡等遺傳特性，其主要功能是編碼細胞表面的轉膜蛋白，通過傳遞抗原給T淋巴細胞參與調節免疫反應。MHC基因由Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類基因組成。山羊的MHC基因稱之為GOLA（Goat?lymphocyte?antigen），即山羊白細胞抗原。MHC基因多態性賦予動物極大的應變能力，長期自然選擇使動物具有應變多變的環境條件及各種病原體的侵襲的能力，若動物具有高的MHC多態性，則能夠識別更多的抗原，從而抵抗更多種類的病原體。因此，MHC可以作為抗病育種的遺傳標記輔助選擇的重要位點，以培育出高產、抗病力強的家畜品種。單核苷酸多態性（SNP）指基因組DNA序列中由于單個核苷酸（A/T/C/G）的替換而引起的多態性，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。位于編碼區的SNPs的錯義突變可能對基因的功能有重要的影響，不僅如此，這些SNPs位點多為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。單核苷酸多態性具有數量多，分布廣和穩定遺傳等特點，是一種進行分子遺傳育種的優良手段。現在人們發展了許多用于探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術（SSCP）、PCR-RFLP和直接測序技術等，SSCP它可以發現靶DNA片段中未知位置的堿基突變。該方法具有簡單、快速、靈敏，操作簡單等優點。但對于像DQA1基因外顯子2這種呈高度多態性的基因，基因型的判定成為難點。貴州白山羊是貴州省的優良地方山羊品種，具有適應性強、耐粗飼、繁殖力高、育肥性能好、肉質好、板皮質優等特點，宜于在山地丘陵等地勢放牧飼養。但國內對于貴州白山羊免疫性狀的研究還鮮見報道，所以如何利用分子生物學的技術快速高效的篩選培育出具有較高抗病能力的貴州白山羊成為改良我國優良地方山羊品種的重中之重。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的引物及方法，為不同品種山羊DQA1基因外顯子4多態性的PCR-SSCP篩選及判型提供一種方便、快捷、準確的方法，以克服現有技術的不足。本專利技術采用的技術方案：本專利技術檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的檢測引物，由上游引物和下游引物組成，所述上游引物和下游引物的DNA序列為：???上游引物：5’-AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3’下游引物：5’-TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3’。本專利技術檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的方法，包括以下步驟：以山羊基因組DNA為模板，利用權利要求1所述的上、下游引物進行PCR反應擴增目的片段，用變性劑處理PCR產物，對變性后的擴增片段進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，應用銀染法染膠，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果即可判定山羊DQA1基因外顯子4的等位基因。更進一步，PCR反應條件為：在15μL總體系中，2×Es?Taq?MasterMix為7.5μL，上下游引物各為0.75μL，DQA模板為2μL?，余量為ddH2O，PCR反應程序為：95℃預變性3min；95℃變性30s、58.5℃退火30s、72℃延伸1min，30個循環；72℃終延伸5min，4℃保存。上述的變性劑由98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍，0.025%二甲苯青，100μL?5mol/L?EDTA組成。具體的電泳檢測步驟為：采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠在250V電壓下預電泳30min；點樣后，常溫下，250V電泳10min，110v電泳16h。上述非變性聚丙烯酰胺凝膠由?26.6?mL29%的丙烯酰胺-1%N,N-雙丙烯酰胺、?20?mL的5×TBE、720μL10%的過硫酸銨、52.8?mL的ddH2O、44μL的TEMED組成。?本專利技術有益效果：本專利技術引物能夠特異性的結合到山羊基因組DNA目的片段的模板鏈上，可以擴增得到含有等位基因突變的目的基因。通過設計的核苷酸引物以及建立的檢測體系，可較為準確、快捷的擴增群體中不同等位基因型，可以準確的分析得到山羊DQA1基因外顯子4的不同單核苷酸突變位點。附圖說明圖1是貴州白山羊DQA1基因第4外顯子G+87T位點的PCR-SSCP檢測凝膠圖；圖2是貴州白山羊DQA1基因第4外顯子G+149A位點的PCR-SSCP檢測凝膠圖；圖3是貴州白山羊DQA1?Exon?4-?G+87T位點的測序圖；圖4是貴州白山羊DQA1?Exon?4-?G+149A位點的測序圖；其中，附圖中標記1?DQA1?Exon?4-?G+87T?2?DQA1?Exon?4-?G+87G3?DQA1?Exon?4-?T+87T4?DQA1?Exon?4-?G+149G5?DQA1?Exon?4-?A+149A6?DQA1?Exon?4-?G+149A。具體實施方式實施例：下面結合具體實施方案對本專利技術的原理和特征進行描述，所舉實施方案只用于解釋本專利技術，并非用于限定本專利技術的范圍。下面以貴州白山羊免疫性狀相關基因DQA1基因外顯子4的多態性分析為例，對本專利技術的內容進行詳細說明。一種貴州白山羊DQA1?Exon4等位基因PCR-SSCP檢測方法，其主要特點在于，具體的檢測步驟如下：1、樣品的采集：采集健康狀況好的成年貴州白山羊，抗凝管進行頸靜脈采血8mL，冰盒帶回實驗室后-20℃保存；2、基因組DNA的提取：應用血液基因組提取試劑盒（上海生工生物）提取基因組DNA；3、引物設計與PCR反應：總體系為15μL，其中2×Es?Taq?MasterMix為7.5μL，上下游引物各0.75μL，DQA模板2μL?，ddH2O補充體積至15μL；PCR反應程序：95℃預變性3min；95℃變性30s、58.5℃退火30s、72℃延伸1min，30個循環；72℃終延伸5min，4℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。引物序列為：上游引物：5’-AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3’下游引物：5’-TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3’4??PCR產物的SSCP檢測：取8μLPCR產物加入10μL的上樣變性緩沖液，包括98%去離子甲酰胺，0.025%溴酚藍，0.025%二甲苯青，100μL?5mol/L?EDTA(PH=8.0)。98℃變性15min，立即冰浴15min；8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，250V電壓下預電泳30min；點樣后，常溫下，250V電泳10min，110v電泳16h，銀染法顯色并拍照。（1）電本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的檢測引物，由上游引物和下游引物組成，其特征在于：所述上游引物和下游引物的DNA序列為：???上游引物：5’?AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT?3’下游引物：5’?TGGGAACATAGTACAGACGAGG?3’。

【技術特征摘要】
1.一種檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的檢測引物，由上游引物和下游引物組成，其特征在于：所述上游引物和下游引物的DNA序列為：???
上游引物：5’-AGTCTGTAGAACCAACCCCTCT-3’
下游引物：5’-TGGGAACATAGTACAGACGAGG-3’。
2.一種檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的方法，其特征在于：包括以下步驟：以山羊基因組DNA為模板，利用權利要求1所述的上、下游引物進行PCR反應擴增目的片段，用變性劑處理PCR產物，對變性后的擴增片段進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，應用銀染法染膠，根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果即可判定山羊DQA1基因外顯子4的等位基因。
3.如權利要求2所述的一種檢測山羊免疫相關基因DQA1基因的單核苷酸多態性的方法，其特征在于：PCR反應條件為：在15μL總體系中，2×Es?Taq?MasterMix為7.5μL，上下游引物各為0.75μL，DQA模板為2μL?，余量為ddH2O，...

【專利技術屬性】
技術研發人員：羅衛星，劉彬，蔡慧芬，康建兵，孫巖巖，錢成，
申請(專利權)人：貴州大學，
類型：發明
國別省市：貴州;52