從哺乳動物組織分離的椎間盤細胞、使用方法及其制備方法技術

本發明專利技術涉及椎間盤細胞群、衍生(deriving)方法、及其使用方法。所述的椎間盤細胞群可用于修復或再生對象受損、患病或缺失的椎間盤。所述的椎間盤細胞群可衍生自、施用或植入一對象，或者可以衍生自一個無關的供體。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】從晡乳動物組織分離的椎間盤細胞、使用方法及其制備方法相關申請的交叉引用根據35U.S.C.§ 119(e)，本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請N0.61/794，691的優先權，其全部內容通過引用并入本文。專利
該公開內容涉及椎間盤細胞的分離以及在退行性椎間盤疾病的治療中的使用方法。專利技術背景哺乳動物的脊椎起著兩大基本功能:(I)上半身的負載和(2)保護組成脊柱的神經。脊柱是由聯鎖的椎骨組成，由椎間盤分隔。這些(椎間)盤充當著減震器，并使脊柱能夠彎曲，壓縮，和扭曲。椎間盤具有兩個基本部分:外纖維結構(纖維環)和凝膠狀內部結構(髓核)。在青年哺乳動物體內，健康髓核的80%為水。隨著時間流逝，髓核的高含量水丟失，進而喪失吸收沖擊的能力。此外，椎間盤可由于脫水、疾病、過度使用、損傷或創傷引起破裂、腫脹、疝等。椎間盤也容易為其他疾病所影響，如椎間盤退行性病變。在健康的椎間盤中，細胞只占有總體積的很小部分。大量的椎間盤體積是細胞產生的細胞外基質(ECM ;膠原蛋白和蛋白聚糖，其協助保留了大量的水分)，并且髓核和纖維環的大多數區別在于含水量和ECM的組成。椎間盤退行性病變所導致的背部疼痛是導致發病、殘疾和喪失勞動力的一個重要原因。背部疼痛常常被認為是限制45歲以下人群活動以及就診、住院和外科手術的原因。每年，人群中15% -45%會報告慢性背部狀況發生，而在其生命的某一段時間，則有人群中70%至85%報告。在醫療健康支出以及喪失的工作時間方面，對于社會財政的影響巨大。在美國，每年需要進行一百多萬例脊椎手術。更有甚者，脊柱外科的腰椎節段融市場估計具有超過十億美元的年收入。盡管對于遭受背部疼痛和脊柱疾病的患者的手術和非手術治療方案都在持續進步，卻沒有消除或持續改善這種狀態的解決方案。目前，脊柱疾病的治療方法包括類固醇注射，物理療法，椎間盤切除術和脊柱融合術。多家公司推出了脊椎假體。然而，這些假體在設計上，例如，在軸承表面、骨質固定、關節數量、材料、約束、旋轉的移動性上，有很大的不同，且在實踐中收效甚微。核置換或髓核置換也是可作為治療退行性盤疾病的選擇。在一些情況下，這些設備由聚乙烯套筒包裹水凝膠核心組成其能使該裝置在正常裝卸過程中的收縮和溶脹。這可以部分地幫助恢復椎間隙高度，并有助于模仿健康人的盤。盤置換并非沒有并發癥。最常見的并發癥包括鄰近水平的脊椎疾病、沉降和關節面炎癥。而且，來源于臨床試驗的最近研究表明了感染、椎體骨折、植入位置不正、沉降、機械故障和椎旁異位骨化的事件。還報道有更嚴重的并發癥，包括植入物的前脫位。此外，全椎間盤成形術中的磨損粒子產生和對脊髓的潛在影響的問題仍然是未知的。目前所需要的是可有助于將對象的椎間盤進行修復或更換椎間盤生物療法。專利技術概述本文公開的是分離的椎間盤細胞群，其使用方法，以及制備方法。所述的椎間盤細胞群被用于修復、重建以及更換損壞、受傷、或患病的椎間盤。在一些實施方式中，椎間盤細胞群衍生自從哺乳動物椎間盤組織，并在體外以非貼壁依賴條件下生長。在一些實施例中，細胞培養基包含含有一種或多種選自下組的添加劑的介質:EGF、bFGF、血清，成纖維細胞調節介質，和粘性非反應性物質。在一些案例中，所述的細胞生長于含有低粘附涂層的容器中。所述的椎間盤細胞群可以在需要的對象中組合用于自體和/或非自體椎間盤治療。所述的椎間盤細胞可使用非可吸收材料或可吸收材料而在體外或體內體內用作生產人工椎間盤替代物。所述的材料可以創建一個人工環來容納椎間盤細胞群，其可以單獨或與以下各項中的至少一種進行組合一一支架材料、基質材料、載體材料、生長因子和/或其它生物活性劑。人造環可以包括連接裝置，以便它可以被固定到一個或多個椎體上。例如，所述的人工換可以包括通孔、扣、連接端環、或墊圈，以使其能夠螺合固定至一個或多個椎體上。人造椎間盤可手術植入主體，從而完全取代椎間盤。本申請公開了各種從自體和非自體供體來來獲得并椎間盤源性細胞的方法。本申請公開了一種椎間盤源性細胞群的衍生方法，所述的方法包括:從組織中分離一個或多個細胞；在貼壁依賴中對所述一個或多個細胞進行培養；將所述的一個或多個細胞轉移至非貼壁依賴中。本申請還公開了一種方法，通過向所需對象使用治療量的椎間盤源性細胞群以對所述對象至少一個椎間盤進行治療，從而治療所述對象。在各種實施方案中，所述的組織是哺乳動物椎間盤組織，例如，來自于捐贈的器官或脊椎。在一些方面，所公開的方法包括，將所述細胞群在貼壁依賴至少傳代一段時間，和所述細胞群產生細胞外基質。在一些方面，所述的細胞群產生一個或多個選自下組的細胞表面標記物:⑶24、⑶34、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166、Stro-1、HIFl、巢蛋白、CK8和HLA蛋白，其中表達一個或多個細胞表面標記物的細胞在細胞群中的百分比大于70%或小于40%。在本專利技術所公開的方法的一些方面中，所述細胞群表達一種或多種選自下組的基因或基因產物:GAPDH、SDHA,HPRTl、B2M、Sox9、聚蛋白多糖、Co 11、Co 12、巢蛋白、CK8、Sox 1、CD44、ALP1、PPARG、ADAMTS、MMP、FMOD、和IL0在另一方面，本申請描述了椎間盤源性細胞群，其中大于40%的所述細胞產生細胞表面標記物CD44、CD73、CD90、HLA-A、B或C、CD24、CD105、CD166、或其組合，且小于約20%的細胞群產生⑶34、HLA-DR或-DQ、或STR0-1。在一些實施方案中，約80-100%的細胞群產生⑶73、⑶90、⑶44、HLA ABC、或其組合。在一些實施方案中，約20-75%的細胞群產生CD105、CD166、CD24、或其組合。根據一個方面，本專利技術提供一種治療至少一個椎間盤患有疾病或損傷的的對象的方法，所述椎間盤的疾病或損傷是由年齡、創傷、毒素暴露、藥物暴露、放射暴露、氧化、免疫復合物沉積或移植排斥誘發的。根據另一個方面，本專利技術提供了用于治療至少一個椎間盤患有疾病或損傷對象的試劑盒，其包含藥學上可接受的載體，治療疾病或損傷有效量的椎間盤源性細胞，脊柱組織，并且其中所述細胞能夠在培養基中擴增，并具有分化的潛能。在一些實施例中，所述的試劑盒包括至少一種制劑。附圖簡要說明本專利的文件包含至少一張彩色圖片/照片。帶有彩色圖片/照片的本專利文件的副本在請求并支付了必要的費用情況下，將由專利局提供。本專利技術的主題在說明書的結論部分被特別地指出并清楚地要求。然而，所述的專利技術無論是對于組織和操作方法，以及目的，特征和優點，通過以下詳述作為參考，當與附圖一同閱讀時，用于對本專利技術進行最好的理解，其中:圖1示出的已知的，用于確定干細胞和成軟骨細胞的各種表面標記物表達譜。檢測了八種細胞類型:成纖維細胞，軟骨細胞，間充質干細胞(MSCs)，單層培養椎間盤細胞(貼壁)，以及懸浮培養的椎間盤細胞(非貼壁)。圖2顯示了在懸浮培養基中生長的椎間盤源性細胞的細胞形態。圖3顯示了椎間盤源性細胞與MSC的軟骨分化潛能對比。圖4顯示了椎間盤源性細胞的成脂和成骨潛能。圖5顯示了在與粘性I %透明質酸支架組合，然后通過27G1.5英寸手術針擠出后細胞的存活率(綠色，或在黑/白中顯亮色-活，紅色或黑/白中顯暗色-死)。圖本文檔來自技高網...

【技術保護點】
椎間盤細胞群，包括：至少一個細胞，其衍生自哺乳動物椎間盤組織且在體外非貼壁依賴培養基中生長的。

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：L·I·西爾弗曼，K·T·福利，
申請(專利權)人：迪斯吉尼科斯有限公司，
類型：發明
國別省市：美國;US