一種長期體外培養(yǎng)和擴增肝細胞的方法及其應用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種長期體外培養(yǎng)和擴增肝細胞的方法，該方法在體外將成熟肝實質(zhì)細胞誘導成為具有無限增殖能力的肝細胞，本發(fā)明專利技術(shù)制備得到的肝細胞可用于化合物和藥物的毒理學和藥理學評價、肝炎病毒的研究和診療、肝細胞移植治療、生物人工肝的制備等應用。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及生物
，具體涉及一種長期體外培養(yǎng)和擴增肝細胞的方法，該方法在體外將成熟肝實質(zhì)細胞誘導成為具有無限增殖能力的肝細胞，所述的肝細胞可用于化合物和藥物的毒理學和藥理學評價、肝炎病毒的研究和診療、肝細胞移植治療、生物人工肝的制備等應用。
技術(shù)介紹
一、肝臟與肝細胞肝臟是動物體內(nèi)以代謝功能為主的重要生命器官，調(diào)控著多種生理功能，主要包括解毒，儲存肝糖原，合成分泌性蛋白質(zhì)以及生成膽汁等。肝臟本身具有強大的再生能力，正常肝臟經(jīng)三分之二部分肝切除后，殘留的成熟肝細胞可快速增殖，并完全取代和恢復缺失肝臟的體積和功能。但是在罹患各種肝臟疾病，包括肝炎，肝硬化，肝癌，肝臟代謝疾病和肝功能衰竭時，肝臟逐漸失去再生能力，從而導致其生理功能不斷下降，最終危害人們的健康和生命。全世界受肝病影響的患者超過5億，一旦發(fā)展為終末期肝病或急性肝衰竭，目前唯一有效的治療手段是進行肝臟移植。但是由于肝臟供體持續(xù)緊缺以及術(shù)后免疫系統(tǒng)對異體器官的排斥，移植手術(shù)的發(fā)展受到了嚴重的制約。最近基于肝細胞治療的技術(shù)受到了廣泛的關(guān)注，其中包括肝細胞移植，肝臟組織的體外重建和生物人工肝等，被認為是全器官移植較理想的替代方式。然而，由于成熟肝細胞無法長期體外培養(yǎng)和擴增，該方法仍舊依賴于捐獻的供體肝臟，并且不能改變移植后的免疫排斥。此外，體外培養(yǎng)的肝細胞還是非常好的藥物肝臟代謝模型以及肝炎病毒研究模型，被廣大制藥公司和研究機構(gòu)大量使用。因此如何獲得穩(wěn)定而大量的肝細胞來源，成為目前最迫切的需要。在過去的數(shù)十年中，研究者進行了各種各樣的嘗試，期望在體外重現(xiàn)肝細胞特有的強大增殖潛能。然而迄今為止，尚無報道可在體外長期培養(yǎng)和擴增各種動物的正常肝實質(zhì)細胞。為了克服原代肝細胞在體外的生長限制，研究者通過導入SV40病毒蛋白(大T抗原或小T抗原)實現(xiàn)了正常肝細胞的永生化(如Fa2N-4細胞系)。此外一些來自于腫瘤的細胞系被建立起來，并表現(xiàn)出一些成熟肝細胞的形態(tài)和功能(如IfepaRG細胞系)。雖然這些細胞可在體外無限培養(yǎng)和擴增，但出于安全性的考慮以及肝細胞功能上的異常(包括P450活性的異質(zhì)性)，它們的實際應用受到極大限制，通常僅作為藥物代謝和毒性篩查模型，在一些制藥公司被少量使用(Vallier L.,Heps with Pep:Direct Reprogramming intoHuman Hepatocytes, Cell Stem Cell, 14, March 6,2014,267-269)。近來，利用干細胞或其他細胞來分化獲得肝細胞被認為是未來肝細胞的重要來源。可誘導多能干細胞(iPS)和譜系重編程技術(shù)的誕生更是使得建立個體化肝細胞，并最終實現(xiàn)個性化醫(yī)學變得可能。目前已有多個報道可成功地將哺乳動物的胚胎干細胞(ES)和iPS細胞定向分化成具有肝臟功能的細胞。此外，研究者還成功地將體細胞通過譜系重編程直接轉(zhuǎn)分化為肝細胞，并證明這些細胞可在肝臟中增殖及重建肝臟功能。但是，無論由ES細胞，iPS細胞還是譜系重編程分化獲得肝細胞，都不可能達到百分之百的效率，殘存的干細胞注射入動物體內(nèi)后可能形成畸胎瘤和腺瘤，因此嚴重影響了這些細胞的應用。此外，ES細胞取材困難且受到倫理學上的嚴格限制，而iPS細胞和譜系重編程均涉及多個外源基因?qū)耄浒踩院透渭毎δ芘c上述永生化的肝細胞相似，因此它們的實際應用也有較大限制。因此，最理想的肝細胞來源還是原代肝細胞，如果能實現(xiàn)原代肝細胞的長期體外培養(yǎng)和擴增，并保持正常肝細胞遺傳學和功能的穩(wěn)定性，將極大推動人類對肝臟的認識和肝病的診療。二、肝細胞特征肝細胞可以根據(jù)許多表型標準進行表征，包括所表達的細胞標記，酶活性，形態(tài)特征和細胞間信號特性的檢測或定量。成熟肝細胞的形態(tài)特征為其具有原代肝細胞的形態(tài)特征。該特征包括任何或所有下列各項:多邊形細胞形狀，雙核表型，用于合成分泌蛋白的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，用于細胞內(nèi)蛋白分選的高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體復合體，過氧化物酶體和糖原顆粒，相對豐富的線粒體，并且形成細胞間的微膽管空間。成熟肝細胞也可以根據(jù)其是否表達肝系特征性標志物來鑒定，包括白蛋白，唾液酸糖蛋白受體，α?-抗胰蛋白酶，α-胎蛋白，載脂蛋白Ε，精氨酸酶I，載脂蛋白Al，apoAI I，載脂蛋白B，apoCI 11，apoCI I，醛縮酶B，醇脫氫酶I，過氧化氫酶，CYP3A4，葡萄糖激酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胰島素生長因子I和2，IGF-1受體，胰島素受體，瘦素，肝特異性有機陰離子轉(zhuǎn)運體(LST-1)，L-型脂肪酸結(jié)合蛋白，苯丙氨酸羥化酶，轉(zhuǎn)鐵蛋白，視黃醇結(jié)合蛋白，促紅細胞生成素(EPO)。成熟肝細胞標記物包括但不限于，白蛋白，a 1-抗胰蛋白酶，唾液酸糖蛋白受體，細胞角蛋白8(CK8)，細胞角蛋白18(CK18)，CYP3A4，富馬酰乙酰乙酸水解酶(FAH)，葡萄糖-6-磷酸酶，酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，磷酸烯醇丙酮酸烯醇和色氨酸2，3-雙加氧酶。可以使用任何合適的免疫學技術(shù),如采用流式細胞術(shù)分析細胞表面標記,采用免疫組織化學檢測細胞表面或細胞內(nèi)的肝細胞標志物，采用Western印跡分析細胞裂解液中標志物的表達水平，采用酶聯(lián)免疫分析，對細胞裂解液或分泌到培養(yǎng)基中產(chǎn)物進行檢測。也可以通過Northern印跡分析,斑點印跡雜交分析,或?qū)崟r定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)等方法檢測肝細胞特異性標志物mRNA水平的表達情況(美國專利號US5843780)。還可以根據(jù)細胞是否顯示酶活性鑒定其肝細胞特性。例如，測定對葡萄糖-6-磷酸酶活性，測定堿性憐酸酶(ALP)和 5’-核苷酸酶活性等(Maurel P., Hepatocytes-Methods and Protocols,METHODS IN MOLECULAR B1LOGY, ISSN 1064-3745)。成熟肝細胞還可通過檢測解毒活性確定其功能。細胞色素P450是單加氧酶系統(tǒng)的關(guān)鍵催化組分。該家族負責外來物質(zhì)(如服用的藥物)和許多內(nèi)源性化合物的氧化代謝。不同的細胞色素存在特性和重疊的底物特異性。大部分的生物轉(zhuǎn)化能力是由CYP1A2，2A6，2B6, 3A4，2C 9_11，2D6和2E1等細胞色素實現(xiàn)的。可通過檢測細胞色素P450酶的活性反映細胞解毒功能。檢測CYP3A4的解毒活性可使用P450-Glo?CYP3A4 DMSO耐受試驗(熒光素-PPXE)和 P450-Glo?CYP3A4 cell-based/b1chemical 法(熒光素-PFBE) (Promega公司LNC，#V8911和V8901#)，還可采用CYP3A4酶的熒光底物DBOMF進行流式細胞術(shù)檢測。檢測CYPlAl和/或CYPlBl的解毒活性可使用P450-Glo?檢測(熒光素-CEE) (Promega公司#V8762)。檢測CYP1A2和/或CYP4A解毒活性使用的是P450-Glo?檢測(熒光素-ME)(Promega公司公司#V8772)。檢測CYP2C9解毒活性可使用P450_Glo?CYP2C9法(熒光素-H) (Promega 公司，評8791)。成熟肝細胞還可通過生物功能分析如糖原儲存、尿素產(chǎn)生、膽汁分泌以及脂質(zhì)合成來進行評估。糖原貯積通過碘酸雪夫(PAS)染色進行測定，陽性為特征性的本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種體外培養(yǎng)和擴增肝細胞的方法，其特征在于，該方法在體外將肝實質(zhì)細胞誘導成為具有無限增殖能力的肝細胞，包括以下步驟：A、采用膠原蛋白I或Matrigel基質(zhì)膠對培養(yǎng)支持物的預包被；B、將肝實質(zhì)細胞傳入步驟A提供的經(jīng)預包被的培養(yǎng)支持物上，在肝細胞增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)和擴增；所述的肝細胞增殖培養(yǎng)基是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加的營養(yǎng)成份組成，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Williams?E或DMEM/F12培養(yǎng)基；所述的添加的營養(yǎng)成分包括5％?10％的血清或血清替代物；C、步驟B獲得的增殖狀態(tài)的肝細胞，轉(zhuǎn)入肝細胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得肝實質(zhì)細胞；所述的肝細胞分化培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Williams?E或DMEM/F12培養(yǎng)基；所述的添加物為5％?10％的血清或血清替代物、0.1％?10％的胰島素?轉(zhuǎn)鐵蛋白?亞硒酸鈉混合補充液、1?100?ng/ml的人肝細胞生長因子、0.1?100μM的地塞米松，以及1?100μM的人抑瘤素?M。D、步驟C獲得的肝細胞的標志物鑒定。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳紅平，
申請(專利權(quán))人：上海賽立維生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31