本發明專利技術涉及一種鹽生草原生質體的制備及純化的方法，它包括以下步驟：1.幼苗的種植；2.葉片的選取；3.原生質體的獲得，用刀片沿其主脈縱切，然后放入酶解液中；4.原生質體的純化，酶解后，加入等體積的洗液，最后用移液槍吸取4-5ml的上清液，即為較純的原生質體；5.原生質體產量的測定，根據加入酶溶液中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質體產量，計算結果以每克葉片原生質體數表示(個/g)。本發明專利技術簡單易行，獲得的原生質體純度高，數量可達8.4×104個/g,也可避免組培污染，能為體細胞的雜交，各種細胞器(如細胞核，葉綠體，線粒體，液泡等)的分離，生物反應器的構建以及原生質體融合育種等奠定基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種鹽生草原生質體的制備及純化的方法，特別地是直接通過酶解葉 片而獲得較純的原生質體的方法。
技術介紹
植物細胞原生質體是指去除細胞壁的產物，是真正的單細胞，可應用于遠緣親本 間的融合，易于導入外源基因，同時也是分離各種細胞器（如細胞核，葉綠體，線粒體，液 泡等）的良好材料，并可為細胞間的物質運輸，信息交換等的研究提供技術支撐。鹽生草 (Halogeton glomeratus)為藜科鹽生草屬一年生草本稀鹽鹽生植物，分布于甘肅西部、青 海、新疆及西藏等地區。近年來因其優良的抗旱耐鹽性能而受到重視，其本身蘊含的大量抗 旱耐鹽相關基因可為作物抗旱耐鹽育種提供寶貴基因資源。原生質體具有該細胞的所有生 命特性，并且全能性較易體現，所以原生質體融合育種技術是選育作物優良品種最為有效 的方法之一，而原生質體的成功制備是原生質體融合育種技術的關鍵所在。目前鹽生草研 究在我國相對薄弱，鹽生草原生質體的制備工作尚未見報道，因此，采用一種高效經濟的方 法制備鹽生草原生質體具有重要的意義。
技術實現思路
本專利技術的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種快速獲得鹽生草葉片原 生質體的方法。該方法簡單易行，獲得的原生質體純度高，數量可達8. 4X104個/g，也可避 免組培污染，能為體細胞的雜交，各種細胞器（如細胞核，葉綠體，線粒體，液泡等）的分離， 生物反應器的構建以及原生質體融合育種等奠定基礎。 為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案為：一種快速獲得鹽生草葉片原生質體 的方法，其主要特點在于步驟為： (1)幼苗的種植，選取飽滿的鹽生草種子3-5月種植于花盆，其蛭石與沙子體積比 為 1:1-3:1 ; (2)葉片的選取，待步驟（1)獲得的幼苗長至1-3個月，用刀片切取靠近植株基部 2/3處的葉片，蒸餾水沖洗三次，待用； (3)原生質體的獲得，將步驟（2)獲得的葉片用濾紙擦干，用刀片沿葉片主脈縱 切，然后放入酶解液中，22-25°C，黑暗條件下酶解2-3h ; (4)原生質體的純化，在步驟（3)酶解后的酶解液中加入等體積的洗液，放置在黑 暗條件下，22-25°C，25-40rpm的水平搖床10-15min，然后用5ml的移液槍將酶解液吸入 l〇ml的試管，接著將其放入22-25°C的離心機2000-3000r離心8-10min，最后用移液槍吸取 4-5ml的上清液，即為純的原生質體； (5)原生質體產量的測定，輕輕吹打步驟（4)所述原生質體，使其分布均勻，用移 液槍吸取一滴在血球計數板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計數，連續計數三次，取平 均值；根據加入酶溶液中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質體產量，計算結果以每 克葉片原生質體數表示（個/g)。 所述的，其步驟（1)所述的幼苗在自然條件 下生長，輕石與沙子120-180°C滅菌4_6h，并每隔3_5d噴灑一次1/2 Hoagland-Hoagland 營養液。 所述的，其步驟（2)所述選取的葉片為靠近 植株基部2/3處，顏色深綠，肉質化嚴重，并且在10-30min內使用。 所述的，其步驟（3)所述的酶解液的組成： 纖維素酶10_30g/L，半纖維素酶5-20g/L，果膠酶5-20g/L，離析酶2-5g/L，甘露醇60-85g/ L，10mM的MES 50-150ml/L，等體積混合，PH為5-6 ;所述的步驟（4)洗液的組成：甘露醇 60-85g/L，10mM 的 MES 50-150ml/L 等體積混合，PH 為 5-6。 所述的，其步驟（3)所述的原生質體的獲 得，在制備原生質體時，清洗后葉片表面用濾紙擦干，然后用刀片在10-30min內沿主脈縱 切，接著用鑷子撥入盛有酶解液的玻璃培養皿中，酶解液用超純水配制，調PH用Κ0Η或HC1。 所述的，其步驟（4)所述的純化原生質體 時，用l〇ml的圓底塑料試管以及水平轉子的離心機，2000-3000r離心8-10min，離心后，將 溶液靜止，時間為5-10min，再吸取4-5ml的上清液，最后在倒置顯微鏡下觀察原生質體的 情況。 所述的，其步驟（5)所述原生質體直徑為 10um-150um之間，原生質體共存于洗液當中。 本專利技術的有益效果如下： 1.以1-3個月盆栽苗的葉片為材料直接酶解獲得原生質體，方便簡單，省時省力， 避免了通過組織培養方法獲得原生質體的麻煩以及組培污染。 2.根據鹽生草葉片的特點優化了酶解體系與條件，獲得的原生質體產量大，純度 尚，活性強。 3.通過直接酶解葉片來獲得原生質體，其特性與自身植株的特性一致，對研究更 具有說服力。 4.通過一次離心就可獲得較純的原生質體，效果良好，杜絕了多次離心造成的浪 費，節省成本。實現了簡單、易行、高效獲得鹽生草原生質體的目標。 5.最終獲得的原生質體大小各異，直徑在10um-150um之間，并且純度高，數量可 達 8. 4X104個/g。【附圖說明】： 圖1.鹽生草葉片的酶解； 圖2.分離純化得到的原生質體； 圖3.實施例1得到的原生質體； 圖4.實施例2得到的原生質體； 圖5.實施例3得到的原生質體； 圖6.實施例4得到的原生質體。【具體實施方式】 以下結合實施例對本專利技術的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本專利技術， 并非用于限定本專利技術的范圍。下面對本專利技術的內容進行詳細的說明。 實施例1 : 一種，其主要特點在于步驟為： (1)幼苗的種植，選取飽滿的鹽生草種子4月種植于花盆，其蛭石與沙子體積比為 1:3 ； (2)葉片的選取，待步驟（1)獲得的幼苗長至3個月，用刀片切取靠近植株基部 2/3處的葉片，蒸餾水沖洗三次，待用； (3)原生質體的獲得，將步驟（2)獲得的葉片用濾紙擦干，用刀片沿葉片主脈縱 切，然后放入酶解液中，22°C，黑暗條件下酶解2h ; (4)原生質體的純化，在步驟（3)酶解后的酶解液中加入等體積的洗液，放置在黑 暗條件下，22°C，30rpm的水平搖床15min,然后用5ml的移液槍將酶解液吸入10ml的試管， 接著將其放入22°C的離心機2500r離心10min，最后用移液槍吸取5ml的上清液，即為純的 原生質體； (5)原生質體產量的測定，輕輕吹打步驟⑷所述原生質體，使其分布均勾，用移 液槍吸取一滴在血球計數板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計數，連續計數三次，取平 均值；根據加入酶溶液中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質體產量，計算結果以每 克葉片原生質體數表示（個/g)。 其步驟（1)所述的幼苗在自然條件下生長，蛭石與沙子160°C滅菌4_6h，并每隔5d 噴灑一次 1/2 Hoagland-Hoagland 營養液。 其步驟（2)所述選取的葉片為靠近植株基部2/3處，顏色深綠，肉質化嚴重，并且 在30min內使用。 其步驟（3)所述的酶解液的組成：纖維素酶20g/L，半纖維素酶15g/L，果膠酶 15g/L，離析酶4g/L，甘露醇75g/L，10mM的MES 120ml/L，等體積混合，PH為5-6 ; 所述的步驟（4)洗液的組成：甘露醇75g/L，10mM的MES 120ml/L等體積混合，PH 為 5-6〇 其步驟（3)所述的原生質體的獲得，在制備原生質體時，清洗后葉片表面用濾紙 擦干，然后用刀本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種快速獲得鹽生草葉片原生質體的方法，其特征在于步驟為：(1)幼苗的種植，選取飽滿的鹽生草種子3?5月種植于花盆，其蛭石與沙子體積比為1:1?3:1；(2)葉片的選取，待步驟(1)獲得的幼苗長至1?3個月，用刀片切取靠近植株基部2/3處的葉片，蒸餾水沖洗三次，待用；(3)原生質體的獲得，將步驟(2)獲得的葉片用濾紙擦干，用刀片沿葉片主脈縱切，然后放入酶解液中,22?25℃，黑暗條件下酶解2?3h；(4)原生質體的純化，在步驟(3)酶解后的酶解液中加入等體積的洗液，放置在黑暗條件下，22?25℃，25?40rpm的水平搖床10?15min,然后用5ml的移液槍將酶解液吸入10ml的試管，接著將其放入22?25℃的離心機2000?3000r離心8?10min，最后用移液槍吸取4?5ml的上清液，即為純的原生質體；(5)原生質體產量的測定，吹打步驟(4)所述原生質體，使其分布均勻，用移液槍吸取一滴在血球計數板上，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡下計數，連續計數三次，取平均值；根據加入酶溶液中葉片的多少計算出每克葉片得到的原生質體產量，計算結果以每克葉片原生質體數表示個/g。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：姚立蓉，王化俊，汪軍成，孟亞雄，李葆春，馬小樂，楊柯，賴勇，司二靜，任盼榮，李吉睿，
申請(專利權)人：甘肅農業大學，
類型：發明
國別省市：甘肅;62
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