本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)旨在提供一種芽孢桿菌、纖溶酶的制備方法及纖溶酶的應(yīng)用。所述芽孢桿菌命名為Bacillus?tequilensis，其保藏編號(hào)為：CGMCC?No.11462；所述生產(chǎn)纖溶酶的方法是將菌種芽孢桿菌（Bacillus?tequilensis）（其保藏編號(hào)為：CGMCC?No.11462）進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到芽孢桿菌纖溶酶；上述方法制備得到的纖溶酶在溶栓藥物中用于激活血液中的纖溶酶原來(lái)講解纖維蛋白。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)可應(yīng)用于食品原料生產(chǎn)及加工領(lǐng)域。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于發(fā)酵工程和生物制藥
，具體地說(shuō)，涉及一種枯草芽孢桿菌、利 用該菌制備纖溶酶的方法及纖溶酶在溶栓藥物中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
血栓病是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和生命的疾病，據(jù)估計(jì)，全世界有血栓病患者約 1500萬(wàn)人，其中每年死于心腦血栓疾病的就高達(dá)1200萬(wàn)人，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)統(tǒng)計(jì)， 由于心肌梗死、腦溢血等血栓性疾病導(dǎo)致的死亡已占到全球總死亡人數(shù)的51%，在我國(guó)，隨 著人們生活水平和生活方式的改變，膳食中高脂肪、高蛋白的過(guò)量攝取，血栓性疾病已超過(guò) 癌癥和糖尿病成為第一大健康殺手。治療血栓病的藥物根據(jù)其不同的作用機(jī)制可分為： 一、纖溶酶原激活劑，如尿激酶（UK)組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑（tPA)等通過(guò)激活血 液中的纖溶酶原來(lái)降解纖維蛋白；二、纖維蛋白酶，如蚓激酶、多種蛇毒抗栓酶等，直接降 解血液中的纖維蛋白。微生物一直都是纖溶酶的重要來(lái)源，尤其芽孢桿菌屬細(xì)菌，已經(jīng)分 離到數(shù)十種不同類(lèi)型的纖溶酶，如分離自Bacillus Subtilis的NK,分離自Bacillus amyloliquefaciens 的 DC4 等，其他如 Bacillus subtilisin Carlsberg， Bacillus cereus等細(xì)菌均有報(bào)道分離到纖溶酶(在Peng, Yong, Xiaojuan Yang, and Yizheng Zhang. ''Microbial fibrinolytic enzymes: an overview of source, production, properties, and thrombolytic activity in vivo.^ Applied microbiology and biotechnology 69.2 (2005): 126-132 有報(bào)道），但利用 Bacillus tequilensis 來(lái)分離制 備纖溶酶卻一直未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，旨在提供一種新型芽孢桿菌 以及利用該芽孢桿菌進(jìn)行纖溶酶生產(chǎn)的方法，還包括該纖溶酶在在溶栓藥物中的應(yīng)用。 本專(zhuān)利技術(shù)所述芽孢桿菌所采用的技術(shù)方案是，該菌株命名為 ie識(shí)/iJeasis，其保藏編號(hào)為：CGMCC No. 11462。 利用上述芽孢桿菌進(jìn)行纖溶酶生產(chǎn)的方法包括以下步驟：將菌種芽孢桿菌 (SaciWys (其保藏編號(hào)為：CGMCC No. 11462)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，從發(fā)酵產(chǎn)物中 分離純化得到芽孢桿菌纖溶酶。 進(jìn)一步地，所述芽孢桿菌分離自土壤，在完成發(fā)酵后，進(jìn)行如下步驟： (1) 發(fā)酵液或固體發(fā)酵產(chǎn)物洗脫液中加入75%硫酸銨完全沉淀蛋白； (2) 溶解沉淀，經(jīng)透析去掉殘余硫酸銨分子； (3) 透析結(jié)束后以MonoQ強(qiáng)陰離子層析，用NaCl洗脫，收集活性部分； (4) 所得具有活性的纖溶酶經(jīng)Sepcryal -100凝膠柱層析，收集活性峰，凍干后得到純 度高于90%的纖溶酶，SDS-PAGE電泳呈單一條帶。 更進(jìn)一步地，在發(fā)酵過(guò)程中，采用的是液體培養(yǎng)基，該液體培養(yǎng)基為：按比例稱(chēng)取 大豆及MgCl2，添加雙蒸水，置于200 ml燒杯中，121°C，20 min滅菌，待冷卻得培養(yǎng)基，其 中的大豆、]\%(：12及雙蒸水的質(zhì)量/質(zhì)量/體積比為w/w/v=10:l:5 ;或者稱(chēng)取蛋白胨：酵母 粉：氯化鈉：氯化鎂（2:1:2:1)的重量溶于100倍體積（w/v)的蒸餾水中，分裝在于200 ml、l/3裝液量的三角瓶中，121°C，20 min滅菌，待冷卻得培養(yǎng)基。 利用上述方法制備得到的纖溶酶在溶栓藥物中的應(yīng)用，所述纖溶酶在溶栓藥物中 用于激活血液中的纖溶酶原來(lái)講解纖維蛋白。 本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果是：本專(zhuān)利技術(shù)方法制備得到的酶可以直接、迅速降解纖維蛋白，具 有良好的血栓溶解作用，分子量較尿激酶小，引發(fā)人體免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)較低，具有開(kāi)發(fā)成臨床 藥物的重要價(jià)值。同時(shí)，該酶的生產(chǎn)原材料豐富，成本低廉，制備工藝簡(jiǎn)單，易放大實(shí)現(xiàn)工業(yè) 化生產(chǎn)，是一種可用于膳食補(bǔ)充劑和藥物的重要溶栓成分。【附圖說(shuō)明】 圖1為制備所得高純度酶經(jīng)SDS-PAGE電泳后呈單一條帶； 圖2為使用纖維平板法測(cè)定酶活性，經(jīng)2h后該纖溶酶所產(chǎn)生的纖溶圈。【具體實(shí)施方式】 下面，以具體的實(shí)施例對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)作更進(jìn)一步的說(shuō)明。 (-）芽孢桿菌的分離制備 將采自廣東省珠海市的土壤樣品，經(jīng)無(wú)菌水稀釋?zhuān)o置取上清，稀釋后采用涂板法用纖 維蛋白培養(yǎng)基進(jìn)行篩選分離(每升培養(yǎng)基含蛋白胨：5g，酵母粉：2g，技術(shù)瓊脂：18g，脫 脂牛奶：250 ml )，能夠在纖維蛋白平板上形成透明圈的菌種單獨(dú)挑出進(jìn)一步培養(yǎng)。 對(duì)于第一步培養(yǎng)的細(xì)菌采用改進(jìn)后的纖維蛋白平板(纖維蛋白原：5g，硫酸銨： 2g，CaCl2: lg，K2HP04:0.1g，KH2P04:0.1g，MgS0 4: 0.2g)進(jìn)行復(fù)篩，對(duì)于能夠在次形成 透明圈的菌株進(jìn)行培養(yǎng)保存。 (二）選取形成透明圈直徑最大的菌株，提取其16s rDNA進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，16s rDNA信息為該菌株鑒定的主要依據(jù)。其中，在測(cè)序中，正向引 物為 27f :5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ；反向引物 1492r :5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。 (三）纖溶酶的制備 實(shí)施例一： 稱(chēng)取20克大豆及2 g MgCl2，添加雙蒸水10 ml，置于200 ml燒杯中，121°C，20 min 滅菌，待冷卻后，接種一環(huán)Bacillus tequilensis菌種。32°C，72 h發(fā)酵。 發(fā)酵完成后將200 ml無(wú)菌水加入培養(yǎng)基，攪拌0.5 h，4層紗布過(guò)濾除去菌體及 不溶性雜質(zhì)，其余雜質(zhì)可使用11500 rpm，20 min離心除去。緩慢加入112 g固體硫酸銨， 攪拌均勻，4°C靜置1 h，待酶完全沉淀。 沉淀加入45 ml Na2C03/NaHC03(30 mM pH 9.2)溶液完全溶解，使用分子量為5 kDa或8 kDa的透析袋在Na2C03/NaHC03 (30 mM pH 9. 2)溶液中進(jìn)行當(dāng)前第1頁(yè)1 2 本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種芽孢桿菌，其特征在于：該菌株命名為Bacillus?tequilensis，其保藏編號(hào)為：CGMCC?No.11462。
【技術(shù)特征摘要】
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：辛雄，雷波，蔡宗葦，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：辛雄，雷波，蔡宗葦，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44
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