一種快速中止CAR-T細(xì)胞殺傷作用的分子剎車及其用途制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)屬于免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種快速中止嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞(T?cell?engineered?with?chimeric?antigen?receptors,CAR-T)殺傷作用的分子剎車及其用途。具體地，該分子剎車作為一個(gè)元件插入CAR內(nèi)部特定位置，能快速中止CAR-T細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用，從而有效提高CAR-T治療的安全性。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及表達(dá)所述CAR的免疫反應(yīng)細(xì)胞，以及所述免疫反應(yīng)細(xì)胞用于制備治療惡性腫瘤或者病毒感染性疾病的藥物中的用途。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及一種快速中止CAR-T細(xì)胞殺傷作用 的分子剎車及其用途。具體地，該分子剎車作為一個(gè)元件插入嵌合抗原受體（chimeric antigenreceptors,CAR)內(nèi)部特定位置，能快速中止嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞對祀細(xì)胞的 殺傷作用。本專利技術(shù)還設(shè)及表達(dá)包含該分子剎車的CAR-T細(xì)胞用于惡性腫瘤及病毒感染性疾 病的藥物中的用途。
技術(shù)介紹
嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞khimericantigenreceptorengineeringT cells,簡稱CAR-T細(xì)胞）在難治性的B細(xì)胞惡性腫瘤的治療中已取得巨大成功，完全緩解 率達(dá)到90% ;在其它實(shí)體瘤的治療中也顯示了良好的應(yīng)用前景。但CAR-T細(xì)胞在臨床應(yīng)用 中可能產(chǎn)生針對正常組織細(xì)胞的誤攻擊（脫祀效應(yīng)，ontarget/off-tumoreffect),或由 于大量釋放炎性細(xì)胞因子引起細(xì)胞因子風(fēng)暴等毒副作用。因而，如何提高CAR-T細(xì)胞治療 的安全性是一大棘手問題。 嵌合抗原受體（CAR)由一個(gè)單鏈抗體（scFv，由抗體\區(qū)氨基酸序列和VΗ區(qū)氨基 酸序列經(jīng)Linker連接而成），通過較鏈結(jié)構(gòu)與源于TCR復(fù)合體或者I姐高親和受體的跨膜 和胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)連接構(gòu)成。表達(dá)CAR的T細(xì)胞可通過非MHC限制性途徑與抗原反應(yīng)。此 夕F，與常規(guī)的TCR只能針對的蛋白抗原相比，CAR并不局限于蛋白抗原，還包括糖類和糖脂 類TAA，而運(yùn)些抗原不像蛋白抗原那么容易突變（化rr化inImmunol2009;21:215-23; Blood2010;116:1035-44;CancerRes2011;71:3175-81;JCancer2011;2:378-82)。 自1989年，由Es化ar和其同事首次提出CAR的概念W來，其已經(jīng)歷了Ξ個(gè)不同的發(fā)展階 段。第一代CAR受體，包含胞外特異識別腫瘤抗原的scFv片段，胞內(nèi)激活信號由CD3ζ 或FcεRI丫 的ITAM(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs)信號鏈來 傳遞。但是第一代CAR受體缺乏Τ細(xì)胞的共刺激信號，導(dǎo)致Τ細(xì)胞只能發(fā)揮瞬間效應(yīng)，在 體內(nèi)存在時(shí)間短、細(xì)胞因子分泌少。第二代CAR受體在第一代CAR的基礎(chǔ)上增加了一個(gè) 共刺激信號分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，提供T細(xì)胞活化的兩種信號，包括如CD28,CD134/0X40， CD137/4-1BB，lymphocyte-specificproteintyrosinekinase(LCK)，inducibleT-cell c〇-stimulato;r(IC0。^及0酷乂-日(：1:;1proteinlO(DAPlO)等結(jié)構(gòu)域，增強(qiáng)了T細(xì)胞 的增殖能力及細(xì)胞因子的分泌功能，比-2、IFN-丫W(wǎng)及GM-CSF增加，從而突破腫瘤微環(huán)境 的免疫抑制、延長AICD(activationinducedcelldeath,AICD)。第Ξ代CAR受體，在第二 代CAR的基礎(chǔ)上，增加了另外一種共刺激信號分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，如在共刺激結(jié)構(gòu)CD28和 ITAM信號鏈的之間再融合一個(gè)二級共刺激分子如4-1BB，產(chǎn)生一個(gè)Ξ重信號的CAR受體，第 Ξ代CAR受體改造的T細(xì)胞具有更好的效應(yīng)功能和體內(nèi)存活時(shí)間。 可W看到，第一代CAR只提供T細(xì)胞活化的第一信號，第二代與第Ξ代的CAR是 將T細(xì)胞激活所需的兩個(gè)信號進(jìn)行了合并，將第二信號CD28或/和4-1BB細(xì)胞內(nèi)信號區(qū)域 直接連接到CD3Z分子，從而繞過了腫瘤細(xì)胞通常第二信號如B7等缺乏所引起T細(xì)胞不能 激活的障礙，第一信號與第二信號合并后，大大提高了對τ細(xì)胞激活、增殖及殺傷能力，使 之療效大幅度增加。但隨之給臨床治療帶來了一定風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)榈诙c第Ξ代CAR修飾后 T細(xì)胞會(huì)針對某些少量表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的正常組織產(chǎn)生超強(qiáng)的反應(yīng)，呈"瀑布"式過量增 加，造成對正常組織的過激免疫反應(yīng)。目前已有兩個(gè)注射CAR修飾后的T細(xì)胞而導(dǎo)致死亡 的病例報(bào)道。其一例應(yīng)用第Ξ代CAR(針對化r2)，患者由于急性肺水腫而死亡，其原因是 CAR"的T細(xì)胞誤攻擊低表達(dá)化r2的肺上皮細(xì)胞（Mol化er2010;18:843-51);另一例應(yīng) 用第二代CAR(針對CD19)，死亡原因復(fù)雜，但伴隨著血液中細(xì)胞因子水平的增高（HumGene Ther2010;21:1039-42;MolTher2010;18:666-8)。在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，11 例腎細(xì)胞癌患 者接受了特異性識別CAIX抗原的第一代CAR-T細(xì)胞治療，其中5例在治療后出現(xiàn)肝臟毒 性，其毒性很可能是因?yàn)镃AR修飾的T細(xì)胞W表達(dá)少量CAIX的膽管上皮細(xì)胞為目標(biāo)，從而 造成了對肝臟的損害（JClinOncol. 2006 ;24(13) :e20-2)。 為解決運(yùn)一安全性隱患，目前最常用方法是引入自殺機(jī)制，使CAR-T細(xì)胞在表達(dá) CAR之外，共表達(dá)一個(gè)自殺基因，例如： 1.代謝型自殺基因：是基于無毒性藥物在基因修飾的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒 性的化合物。例如憐酸化的核巧類似物人單純瘤疹病毒胸巧激酶化SV-TK)與甘昔洛韋 (GCV)相互作用，其產(chǎn)物憐酸形式進(jìn)入DNA作用于DNA聚合酶，導(dǎo)致鏈終止反應(yīng)引發(fā)細(xì) 胞調(diào)亡。服V-TK/GCV也可通過CD95/CD95-L途徑，使Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FA孤）和 caspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡度lood. 2007 ; 110 (12) : 3842-52)。TK自 殺基因已經(jīng)在異體淋己細(xì)胞輸注的臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)，它能消除急性和慢性抗移植物宿 主病。 2.調(diào)亡基因（如：半脫天冬酶）通過誘導(dǎo)調(diào)亡來清除細(xì)胞。iCasp9自殺基因包含 F邸P12-F36V結(jié)構(gòu)域，可通過柔性Ser-Gly-Gly-Gly-Ser連接半脫氨酸天冬氨酸蛋白酶9， 后者不含募集結(jié)構(gòu)域。FKBP12-F36V包含一個(gè)FKBP結(jié)構(gòu)域，在第36個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)上苯 丙氨酸替代了鄉(xiāng)氨酸。它具有高選擇性和亞納摩爾親和力，能夠結(jié)合二聚合成配基，如其他 惰性小分子AP1903。AP1903的使用能激活iCasp9蛋白形成二聚體，從而介導(dǎo)T細(xì)胞調(diào)亡。 iCasp9基因表達(dá)載體系統(tǒng)已經(jīng)在臨床前和I期臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出有效的誘導(dǎo)T細(xì)胞自殺 效果（N化邑1JMed2011 ;365:1673-83)。[000引 3.細(xì)胞表面分子（如CD20)通過抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC)與補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì) 胞毒作用（CDC)來清除細(xì)胞。將已上市的抗體（如美羅華，Rituxan)所識別的抗原祀標(biāo) (如CD20)與CAR基因共同導(dǎo)入T細(xì)胞，CD20與CAR基因作為兩個(gè)獨(dú)立的表達(dá)框，分別整 合到基因組中。使用美羅華抗體后，可W與外源表達(dá)細(xì)胞表面CD20分子結(jié)合，通過ADCC效 應(yīng)與CDC效應(yīng)清除CAR-T細(xì)胞。運(yùn)種自殺基因策略已在臨床前模型中得到驗(yàn)證（HumGene Ther. 2004Jan; 15 (1):63-76)。 然而，CAR-T細(xì)胞脫祀引發(fā)的細(xì)胞因子"瀑布"效應(yīng)速度非常快，運(yùn)些自殺系統(tǒng)未必 能及時(shí)發(fā)揮作用。所W，非常有必要對CAR自身的反應(yīng)體系上進(jìn)行改造，提高CAR-T細(xì)胞治 療的臨床安全性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)人經(jīng)過深入的研本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種嵌合抗原受體，依次包含信號肽、單鏈抗體、胞外鉸鏈區(qū)1、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)，其中，所述單鏈抗體包括輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)以及連接它們的鉸鏈區(qū)2，其中，所述單鏈抗體插入和/或連接有抗原表位；所述抗原表位的插入和/或連接并不降低或者阻斷所述單鏈抗體與其所針對的抗原的特異性結(jié)合；但是當(dāng)所述抗原表位與其特異性抗體結(jié)合后，能夠降低或者阻斷所述單鏈抗體與其所針對的抗原的特異性結(jié)合；所插入和/或連接的抗原表位為單拷貝或者多拷貝(例如2、3、4或5個(gè)拷貝)；所述抗原表位插入和/或連接的位置為一個(gè)或者多個(gè)(2、3、4或5個(gè))；當(dāng)所述位置為多個(gè)時(shí)，不同位置的抗原表位相同或者不同。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：錢其軍，金華君，李林芳，葉真龍，胥階英，呂賽群，吳紅平，吳孟超，
申請(專利權(quán))人：上海細(xì)胞治療研究院，上海細(xì)胞治療工程技術(shù)研究中心有限公司，中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31