本發(fā)明專利技術(shù)適用于食品微生物安全檢測領(lǐng)域，提供了一種針對食品中的金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測用引物組、試劑盒及檢測方法。本發(fā)明專利技術(shù)的多重PCR檢測用引物組、試劑盒及檢測方法通過組合利用金黃色葡萄球菌種屬特異性鑒別基因及耐藥性相關(guān)基因，可實現(xiàn)檢測覆蓋范圍廣、特異性強且靈敏度高的技術(shù)效果，并且檢測耗時短、操作較簡單、設(shè)備要求低，可以節(jié)省大量的人力、物力和財力，適合快速檢測的要求，易于在實際生產(chǎn)中推廣應用。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于食品微生物安全檢測領(lǐng)域，涉及利用多重PCR技術(shù)對食品中的致病菌 進行快速檢測鑒定的引物組、試劑盒及方法。具體而言，本專利技術(shù)涉及針對食品中的金黃色葡 萄球菌（Staphylococcusaureus)的多重PCR檢測用引物組、試劑盒及檢測方法。
技術(shù)介紹
近幾年，食品安全事件頻頻出現(xiàn)，食品安全問題也越來越被社會公眾所關(guān)注和重 視。許多食源性致病菌通過水和食物傳播而引發(fā)食源性疾病，其發(fā)病率和死亡率都呈現(xiàn)逐 漸增加的趨勢。在世界范圍內(nèi)，每年有超過30 %的人口感染食源性疾病，造成數(shù)十億美元的 花銷。預防和控制食源性疾病的發(fā)生和傳播，已成為解決社會食品安全問題的重要舉措之 一。能否及時有效地控制與預防食源性疾病的發(fā)生和傳播，關(guān)鍵在于能否快速準確地檢測 與鑒定食源性致病困。 金黃色葡萄球菌是引起食源性疾病的主要致病菌之一，國內(nèi)外由金黃色葡萄球菌 引發(fā)的食物中毒事件頻頻發(fā)生。據(jù)美國疾病控制中必報告，由金黃色葡萄球菌引起的細菌 性食物中毒居第一位，占整個細菌性食物中毒的33%，在加拿大該數(shù)字則高達45%。我國 每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也很多。目前世界各國都把金黃色葡萄球菌列 為食品衛(wèi)生的法定檢測項目。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和 動物的排泄物中都可找到，因而食品受其污染的機會很多。食品受其污染后，不僅腐敗變 質(zhì)，部分菌株甚至產(chǎn)生多種毒素，如腸毒素、表皮剝脫毒素、殺白細胞素和毒性休克綜合征 毒素等，從而引起局部化賊感染、肺炎、偽膜性腸炎、必包炎等，甚至導致敗血癥、賊毒癥等 全身感染。 在檢測手段上，目前國內(nèi)外檢測機構(gòu)仍主要采用抑A、A0AC、ISO和GB等標準對 金黃色葡萄球菌進行檢測，整個過程一般需要3-5天，上述檢測手段操作復雜，檢測通量不 高，很難滿足對食源性致病菌進行快速準確檢測的現(xiàn)實需求。因此，建立新的對金黃色葡萄 球菌進行快速檢測的方法就顯得尤為迫切。 近年來，借助于免疫學和分子生物學等方法，對金黃色葡萄球菌的快速檢測有了 很大發(fā)展，目前國內(nèi)外針對金黃色葡萄球菌進行快速檢測的方法很多，如；PCR-凝膠電泳 法、實時英光PCR法、基因芯片測試法、全自動細菌生化檢定儀、酶聯(lián)免疫吸附法、英光免疫 檢測法（VIDA巧、膠體金免疫測試條等。但是，免疫學方法如酶聯(lián)免疫吸附法、免疫英光法和 乳膠凝集試驗等在操作程序、檢測時間和特異性等方面尚不理想，并且檢測成本極高；而在 分子生物學方法方面，如PCR技術(shù)則W靈敏、特異、簡便、快速、成本低等優(yōu)點被越來越多地 應用。 由于W單目標基因為檢測對象的單重PCR檢測法假陽性率高，作為改進，目前已 有文獻報道采用多重PCR方法檢測金黃色葡萄球菌。多重PCR檢測法采用將多個目標基因 聯(lián)用的方式，只要檢測出多個目標基因中的任意一種，即可做出初步判斷；進而，通過不同 目標基因間檢測結(jié)果的互相映證，便可實現(xiàn)提高檢測準確度、降低假陽性率的效果。然而， 當所選取的目標基因特異性過高（分布范圍過窄），例如像大多數(shù)現(xiàn)有方法中所側(cè)重的主 要用于醫(yī)學檢測目的的耐藥性相關(guān)基因和毒素基因等，則會造成檢測覆蓋種類不足，從而 造成漏檢等問題；反之，則可能會引起假陽性率高等弊端。因此，對目標基因的選擇仍亟待 優(yōu)化，具體而言，如何選擇對于金黃色葡萄球菌的全部菌株而言具有高覆蓋度和高特異性 的目標基因，仍是多重PCR檢測中的難題。 此外，考慮到食品中僅含有少量金黃色葡萄球菌即會引發(fā)食源性疾病，對檢測方 法的靈敏度也存在較高要求。現(xiàn)有的PCR技術(shù)針對金黃色葡萄球菌的檢測靈敏度通常在 10~10化g/μL左右，并不能完全滿足食品安全國家標準的需求。因此，仍需開發(fā)靈敏度更 高的PCR檢測法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
針對W上不足，本專利技術(shù)組合利用了金黃色葡萄球菌種屬特異性鑒別基因及耐藥性 相關(guān)基因，采用多重PCR技術(shù)對其進行快速檢測。在比對分析金黃色葡萄球菌種屬特異性 鑒別基因及耐藥性相關(guān)基因的基礎(chǔ)上，設(shè)計篩選出金黃色葡萄球菌種屬特異性引物對及引 物組，優(yōu)化組合建立了多重PCR檢測體系，并開發(fā)了金黃色葡萄球菌多重PCR檢測用試劑 盒；同時，結(jié)合樣品前增菌和前處理技術(shù)，建立了檢測覆蓋范圍廣、特異性強且靈敏度高的 檢測方法，由此完成了本專利技術(shù)。 在第一方面，本專利技術(shù)提供了一種用于快速檢測食品中的金黃色葡萄球菌的多重 PCR檢測用引物組，所述引物組包括如下引物對： 耐甲氧西林關(guān)鍵因子A基因（femA基因）擴增用引物對： femA-F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC(沈QIDNO. 1); femA-R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG(SEQIDNO. 2)，[001引W及 耐熱核酸酶基因（nuc基因）擴增用引物對： nuc-F:TACATGTTCAAAGAGTTGTGGATG(SEQIDNO. 3)； nuc-R:ATAAACATCTTGATTTGTTMTGTCTTCTTAC(沈QIDNO. 4)。 在第二方面，本專利技術(shù)提供了一種用于快速檢測食品中的金黃色葡萄球菌的多重 PCR檢測用試劑盒，所述試劑盒中包含本專利技術(shù)的多重PCR檢測用引物組，所述引物組包括如 下引物對： 耐甲氧西林關(guān)鍵因子A基因（femA基因）擴增用引物對： femA-F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC(沈QIDNO. 1); femA-R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG(SEQIDNO. 2),[00川 W及 耐熱核酸酶基因（nuc基因）擴增用引物對： nuc-F:TACATGTTCAAAGAGTTGTGGATG(SEQIDNO. 3)； nuc-R:ATAAACATCTTGATTTGTTMTGTCTTCTTAC(沈QIDNO. 4)。在第Η方面，本專利技術(shù)還提供了一種使用本專利技術(shù)的多重PCR檢測用引物組或試劑盒 對食品中的金黃色葡萄球菌進行快速檢測的方法，所述方法包括W下步驟：a)從所述食品中獲取模板DM的前處理步驟； b)使用本專利技術(shù)的多重PCR檢測用引物組或試劑盒對所述模板DNA進行多重PCR擴 增的步驟；C)對擴增產(chǎn)物進行檢測的步驟， 從而對所述食品中金黃色葡萄球菌的存在及含量進行分析。 本專利技術(shù)所建立的針對食品中的金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測用引物組和試劑 盒及檢測方法通過組合使用耐藥性相關(guān)基因femA和種屬特異性鑒別基因nuc作為目標基 因，具有檢測適用面廣、對金黃色葡萄球菌種屬覆蓋全面、特異性強、靈敏度高等優(yōu)勢，從而 有效解決了文獻中報道的針對金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測方法中由檢測覆蓋種類不 足、引物特異性差及靈敏度不強等因素造成的漏檢、假陽性等問題。此外，本專利技術(shù)提供的針 對食品中的金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測方法還具備檢測耗時短、操作較簡單、設(shè)備要 求低等特點，可大大節(jié)省檢測成本和時間，提高檢測的通量及準確性，具有廣泛的推廣應用 市場前景?！揪唧w實施方式】 根據(jù)本專利技術(shù)的一些實施方式，除本專利技術(shù)的多重PCR檢測用引物組外，本專利技術(shù)的多 重PCR檢測用試劑盒中可進一步包含反應緩沖液、4種脫氧核巧Η磯酸、DNA聚合酶等成分。 根據(jù)本專利技術(shù)一些優(yōu)選的實施方式，除本專利技術(shù)的多重PCR檢測用引物組外，本專利技術(shù) 的多重PCR檢測用試劑盒中可進一步本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種用于檢測食品中的金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測用引物組，所述引物組包括如下引物對：耐甲氧西林關(guān)鍵因子A基因(femA基因)擴增用引物對：femA?F:AAGCACACAACAAGCGAGATAAC；femA?R:TTGATAAAGAAGAAACCAGCAGAG，以及耐熱核酸酶基因(nuc基因)擴增用引物對：nuc?F:TACATGTTCAAAGAGTTGTGGATG；nuc?R:ATAAACATCTTGATTTGTTAATGTCTTCTTAC。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蔡軍，李慧，歐競堃，劉洋，石嵩，黃蔚霞，
申請(專利權(quán))人：中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，中糧集團有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11
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