本發明專利技術涉及一種快速測定白酒發酵過程中微生物群落組成的方法，其特征是通過在PCR反應體系中使用門特異性引物達到白酒發酵過程中對具體某個門的微生物菌群的特異擴增，并使用qPCR體系進行定量擴增，獲得定量識別。本發明專利技術根據已知微生物門類，分別設計了擬桿菌門，變形菌門，厚壁菌門，互養菌門和放線菌門的引物，基于門特異性引物的定量擴增可以在門的層面上快速考察白酒發酵過程中微生物群落的宏觀結構變化。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術設及生物
中的微生物群落操作方法，是基于口特異性引物 (地ylum-specificprimer,PSP)，測定白酒發酵過程中微生物群落組成結構的快速 PSP-qPCR定量方法。
技術介紹
天然復雜微生物群落一般由幾十、幾百甚至更多不同種微生物組成，而且該組成 在不同的環境條件下會發生動態變化。幾乎所有的天然微生物群落所包括的菌種的大部分 人類都了解甚少，所W對白酒發酵過程中天然微生物群落進行現場快速的結構組成定量還 非常困難。目前常見的技術包括： -是傳統培養方法；比如魯泥中大部分微生物屬于未培養菌，使用傳統培養基培 養魯泥微生物速度慢，鑒定工作量很大； 二是焦憐酸高通量測序方法；運是目前國內外流行的一種群落結構定量測定方 法，一般通過生物技術公司委托服務來完成，價格昂貴，可W返回的測序個數高達幾十萬 條，一般可W定性定量到屬； S是FI甜技術；FI甜即fluorescenceinsi1:uhybridization技術是基于堿基 互補的原則，將一小段（通常15-30個堿基，比如16SrRNA片段）巧光標記的核酸序列作 為探針，與載玻片上的目標樣本雜交，與祀序列專一結合，通過檢測雜交位點巧光來顯示特 定核巧酸序列的存在與數量； 四是DGGE/TGGE技術；DGGE即dena1:uredgradientgelelectro地oresis技術 是由Fischer和Lerman1979年最先提出用于檢測DM突變。Myers等1985年在DGGE中 使用"GC夾板"和異源雙鏈技術。Muzyer等1993年證實運種技術在研究微生物群落遺傳 多樣性和種群差異方面非常有效。后來代替化學變性劑的溫度梯度凝膠電泳（temperature gradientgelelectro地oresis,TGGE)是衍生技術。DGGE/TGGE是依據雙鏈DNA片斷烙解 行為的不同，分離PCR產物中長度相近但序列不同的DNA標記片斷（rRNA或rDNA)。DGGE/ TGGE圖上的一個條帶可代表一個微生物類群，分類水平可達種，可方便判斷出優勢菌或功 能菌； 五是T-RFL技術；T-RFLP即Terminal-Restriction打agmentlength poly-mo巧hism技術，是由RFLP發展而來。T-RFLP技術原理是將PCR-條引物標記巧光， 將PCR擴增產物用限制性內切酶消化，產生不同長度的限制性片段，其中一部分含有巧光， 形成T-RFLP圖譜，掲示樣品中微生物的種類、數量等信息； 六是RAPD技術；RAPD是一種DNA多態監測技術，通過PCR擴增，擴增產物經瓊脂 糖凝膠電泳分離、漠化乙錠染色后，來檢測DNA片段多態性。是一種對整個未知序列的基因 組進行多態性分析的分子技術。RATO技術獨特之處在于：1)模扳DNA的需量少，純度要求 低，采用隨機引物；2)操作簡便快速，不需分子雜交等步驟，直接進行DNA多態性分析；3) 所需引物短，在整個基因組內的結合位點多，覆蓋率大，引物可混用，可運用多種引物對基 因組進行大面積的多態分析；4)檢出率高。但RATO結果重現性差； 屯是SSCP技術；1989年，日本科學家化ita利用DNA單鏈構象具有多態性， 在非變性聚丙締酷胺凝膠電泳時遷移率的不同來分析DNA單鏈中的基因突變并提出了 SSCP(Single-StrandConformationPolymo巧hism)的概念。Lee等將SSCP技術應用于 微生物群落的組成分析。化ita等用敏感的銀染法直接對電泳后的凝膠進行染色，建立了 PCR-SSCP分析法，提高了檢測突變方法的簡便性和靈敏性。PCR-SSCP法優點：1)可用非同 位素方法檢測，PCR產物變性后可直接電泳；2)實驗對DNA原始材料純度要求不高，需量少、 成本較低；3)適于大樣本篩查，無需事先知道DNA序列；4)可檢測任何DNA位點上的多態性 和突變，靈敏性高。但該技術也有許多不足，比如分析結果受多種因素的影響，不同的實驗 條件可能導致完全不同的結果；八是AFLP技術；AFLP(AmplifiedRragmentLengthPolymo巧hism)技術 1993 年 由荷蘭Zabeau和Vos創建，結合了RFLP和RAPD技術特點，克服了RFLP技術復雜、有放射 性危害和RAPD技術穩定性差、標記呈現隱性遺傳的缺點，同時兼有RAPD的高效性和RFLP 的可重復性特點。該技術被認為是目前DNA指紋圖譜技術中多態性最為豐富的一項技術， 其主要優點：所需DNA量少、重復性好、多態性強、分辨率高、不需要雜交等。但費用昂貴、對 DNA的純度和內切酶的質量要求較高等。 但是，上述所有技術都無法做到現場兩小時左右的快速測定白酒發酵過程中微生 物群落的組成結構。
技術實現思路
本專利技術是為避免上述現有技術所存在的不足，提供一種定量識別效果顯著、制備 簡便、成本低廉的。 本專利技術為解決技術問題采用如下技術方案： 本專利技術快速測定白酒發酵過程中微生物群落組成的方法的特點是：通過在PCR反 應體系中使用口特異性引物達到白酒發酵過程中對具體某個口的微生物菌群進行特異性 擴增，并使用qPCR體系進行定量擴增，獲得定量識別。 本專利技術快速測定白酒發酵過程中微生物群落組成的方法的特點也在于：按如下步 驟制備口特異性引物： 步驟a、提取釀酒微生物群落樣本的宏基因組作為聚合酶鏈式反應擴增模板； 步驟b、擴增所述擴增模板中的核糖體DNA接近全長16srDNA序列，擴增引物為 27F(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，）和 1492R(5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，）， 獲得擴增產物； 步驟C、對于所述擴增產物經過純化后依次進行TA克隆、藍白斑篩選及白斑菌落 雙向測序，獲得不少于200個的有效克隆，所述有效克隆是指最后的雙向測序序列經過序 列比對確實屬于16srDNA序列； 步驟t對于所述有效克隆雙向測序序列通過進化樹分析，完成引物設計。 本專利技術快速測定白酒發酵過程中微生物群落組成的方法的特點也在于：[002。 對所述qPCR體系的配置：是使用qPCR試劑盒及qPCR儀器，并要求qPCR儀器可W檢測對應試劑盒包含的巧光物質，所述巧光物質包括EvaGreen和SYBRgreen; 對于所述qPCR體系的條件的設定與運行；依據不同微生物群落和不同的口進行 擴增條件的調整優化，定量識別同一個群落的不同的口時設計的引物盡量具備相近的Tm 值，W便在相同的擴增條件進行測試和應用； 對于所述qPCR體系的產物的檢測：在方法建立過程中，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測 擴增產物的純度和質量；在擴增產物達到單一主帶且Tm值分析具備單一產物峰時，不再 需要跑膠檢測產物，使用時qPCR只需要通過Tm值分析判斷即可，利用qPCR儀器同時導出 qPCR擴增曲線、定量結果及Tm值分析結果。 本專利技術快速測定白酒發酵過程中微生物群落組成的方法的特點也在于： 所述口特異性引物為擬桿菌口特異性引物，其引物對核巧酸序列為： 320巧'-CGC ACG GGT GAG TAA CAC GTAT-3'），321(5'-GGG GAT AM TCC TCT CAG TTC CCCT-3'本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種快速測定白酒發酵過程中微生物群落組成的方法，其特征是：通過在PCR反應體系中使用門特異性引物達到白酒發酵過程中對具體某個門的微生物菌群進行特異性擴增，并使用qPCR體系進行定量擴增，獲得定量識別。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：何宏魁，周慶伍，李安軍，羅錫梅，張會敏，劉國英，曹潤潔，湯知輝，張治洲，
申請(專利權)人：安徽瑞思威爾科技有限公司，
類型：發明
國別省市：安徽;34
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。