本發明專利技術公開了一種納米熒光探針測定三聚氰胺的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：（1）金納米粒子的制備；（2）金納米粒子探針的制備；（3）金電極的處理；（4）三聚氰胺的測定；（5）熒光強度的測定。利用二茂鐵作為信號分子和三聚氰胺與胸腺嘧啶之間的特異性結合，通過熒光染料發生脫離并導致熒光探針的顯著激活，實現了對三聚氰胺含量以及熒光度的測定。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于檢測
，具體涉及。
技術介紹
食品工業上普遍采用的、被定為國家標準的是凱氏定氮法。原理是：蛋白質含有氮 元素，用強酸處理樣品，讓蛋白質中的氮元素釋放出來，測定氮的含量，就可以算出蛋白質 的含量。所以凱氏定氮法實際上測的不是蛋白質含量，而是通過測氮含量來推算蛋白質含 量，顯然，如果樣品中還有其它含有氮的化合物，這個方法就不準確了。三聚氰胺是一種有毒的物質，若人體長期攝入三聚氰胺則會造成生殖、泌尿系統 的損害，使膀胱、腎部產生結石，并可進一步誘發膀胱癌?，F有技術中的檢測方法各有其缺 點。金納米熒光探針能與疾病生物標識物高效結合，當向檢測系統加入含巰基化合物如半 胱胺后，金納米粒子表面高效富聚的熒光染料發生脫離并導致熒光探針的顯著激活，熒光 強度與樣品中的生物標識物的濃度成比例，從而達到高靈敏度檢測疾病生物標識物的目 的，但是該方法未用于三聚氰胺的檢測領域，因此，如何專利技術一種納米熒光探針測定三聚氰 胺的方法，使該方法具有簡單，成本低，靈敏度高的特點，是本專利技術要解決的技術問題。
技術實現思路
本專利技術提供，利用二茂鐵作為信號分子和 三聚氰胺與胸腺嘧啶之間的特異性結合，通過熒光染料發生脫離并導致熒光探針的顯著激 活，實現了對三聚氰胺含量以及熒光度的測定。本專利技術采取的技術方案為： ，其特征在于，具體包括如下步驟： (1) 金納米粒子的制備：將濃度為0. 003-0. 005mol/L硝酸銀溶液加熱至沸騰后加入植 酸鈉溶液并持續加熱至沸騰，并保持15_20min后加入濃度為0. 003-0. 005mol/L植酸鈉溶 液，在劇烈攪拌下，加熱至沸后，快速加入質量濃度為1. 5-1. 8%新配制的檸檬酸三鈉溶液， 連續煮沸，待溶液顏色由深藍變為紅色，即可得到紅色的金納米粒子（Au)溶液，冷卻至室溫 后稀釋到100mL，搖勾，直于4 °C冰箱中保存； (2) 金納米粒子探針的制備：將5mg二茂鐵羧酸加入到10mL0.1mol/L的磷酸緩沖 溶液溶液中，再加入含有3-5%羅丹明B異硫氰酸酯的熒光染料，將此混合溶液在室溫下劇 烈攪拌反應2h，離心分離去除過量的熒光染料，用牛血清白蛋白將金納米顆粒表面的活性 位點進行封閉半小時，獲得可激活金納米熒光探針，4°C保存備用； (3) 金電極的處理：首先將金電極在麂皮上分別用氧化鋁粉拋光，依次用乙醇和蒸餾水 分別超聲8min，最后在0.1mol/L氏304溶液中進行循環伏安掃描直至電流電壓曲線穩定； 在潔凈的金電極表面滴加2yMDNAl，在25 °C下組裝12〇11^11，修飾了0嫩1的金電極表 面經充分洗凈后，用高純氮氣吹干，然后將金電極浸入1mM巰基己醇中，25 °C下封閉50 min； (4)三聚氰胺的測定：將10.ΟμL不同濃度的三聚氰胺標準溶液或樣品溶液和10.Ο yLAu-Fc-DNA2復合物溶液滴加到修飾了DNA1的金電極表面，在室溫下反應60min。然 后，用磷酸緩沖溶液反復沖洗電極表面，除去未結合的三聚氰胺和Au-Fc-DNA2復合物，利 用差分脈沖伏安法（DPV)在磷酸緩沖溶液中以100mV/s的掃速進行掃描，電位掃描范圍 為-0. 7~0. 1V。根據電化學信號對三聚氰胺進行定量。 (5)熒光強度的測定：將標準抗原（lpg/mL到100ng/mL)及待測樣本溶液中加入 到96孔板孔中，并在37°C下溫育1小時，將處理后的金電極加入到到96孔板孔中，加入 適量半胱胺（ImM)，避光震搖1分鐘后測試熒光強度。 本專利技術的有益效果為： 本專利技術中金納米粒子的制備工藝簡單、方便，加入了植酸鈉，使金納米粒子之間形成活 性位點，使其具有較強的拉曼增強效應；金納米粒子的檢測結果準確率高，穩定性強。 將熒光染料高效富聚于金納米粒子表面，進一步修飾檢測抗體適配體，金納米熒 光探針能與疾病生物標識物高效結合，金納米粒子表面高效富聚的熒光染料發生脫離并導 致熒光探針的顯著激活，達到高靈敏度檢測疾病生物標識物的目的。 本專利技術在納米金顆粒表面進行熒光染料及待測抗體或核酸適配體修飾，具有熒 光可激活性能。 當三聚氰胺的濃度在0. 3ngmL^700ngmL1之間時，隨著三聚氰胺濃度的變 化，DPV強度有明顯變化，經計算得到檢測三聚氰胺的線性方程為Ipa = 54.45C- 302.8 (Ipa為DPV峰電流強度，單位nA;C為三聚氰胺的濃度，單位ngmL1 ;R2 = 0. 9993，η= 7)。檢測限是0. 1ngmL1 (3 〇 )。通過對濃度為3ngmL1的三聚氰胺進行11次平行測 定而計算得出，相對標準偏差分別為4. 2 %，表明本專利技術的測定方法有較好的重現性。 本專利技術所述的納米金顆粒的表面能高效富集熒光染料分子并使熒光染料有效淬 滅，提高檢測靈敏度，最低可以檢測到lpg/mL水平的生物標志物(三聚氰胺)，靈敏度高，簡 便易行，有利于推廣應用?！揪唧w實施方式】 -種納米熒光探針測定三聚氰胺的方法，其特征在于，具體包括如下步驟： (1) 金納米粒子的制備：將濃度為0. 003-0. 005mol/L硝酸銀溶液加熱至沸騰后加入植 酸鈉溶液并持續加熱至沸騰，并保持15_20min后加入濃度為0. 003-0. 005mol/L植酸鈉溶 液，在劇烈攪拌下，加熱至沸后，快速加入質量濃度為1. 5-1. 8%新配制的檸檬酸三鈉溶液， 連續煮沸，待溶液顏色由深藍變為紅色，即可得到紅色的金納米粒子（Au)溶液，冷卻至室溫 后稀釋到100mL，搖勾，直于4 °C冰箱中保存； (2) 金納米粒子探針的制備：將5mg二茂鐵羧酸加入到10mL0.1mol/L的磷酸緩沖 溶液溶液中，再加入含有3-5%羅丹明B異硫氰酸酯的熒光染料，將此混合溶液在室溫下劇 烈攪拌反應2h，離心分離去除過量的熒光染料，用牛血清白蛋白將金納米顆粒表面的活性 位點進行封閉半小時，獲得可激活金納米熒光探針，4°C保存備用； (3) 金電極的處理：首先將金電極在麂皮上分別用氧化鋁粉拋光，依次用乙醇和蒸餾水 分別超聲8min，最后在0.1mol/L氏304溶液中進行循環伏安掃描直至電流電壓曲線穩定； 在潔凈的金電極表面滴加2yMDNAl，在25 °C下組裝12〇11^11，修飾了0嫩1的金電極表 面經充分洗凈后，用高純氮氣吹干，然后將金電極浸入1mM巰基己醇中，25 °C下封閉50min； (4)三聚氰胺的測定：將10. 0μL不同濃度的三聚氰胺標準溶液或樣品溶液和10. 0yLAu-Fc-DNA2復合物溶液滴加到修飾了DNA1的金電極表面，在室溫下反應60min。然 后，用磷酸緩沖溶液反復沖洗電極表面，除去未結合的三聚氰胺和Au-Fc-DNA2復合物，利 用差分脈沖伏安法（DPV)在磷酸緩沖溶液中以100mV/s的掃速進行掃描，電位掃描范圍 為-0. 7~0. 1V。根據電化學信號對三聚氰胺進行定量。 優選的，所述DNA1 序列為：5' -HS-CCGCTGCCGGTTTTGGTTCGG-3'。 優選的，所述DNA2 序列為：5'-CCGTTCCTTTTCCGG-HS-3'。 根據專利技術的方法對牛奶樣品中三聚氰胺含量進行了測定，并采用標準加入法對方 法進行了評價，樣品測定回收率為96. 0 - 10本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種納米熒光探針測定三聚氰胺的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：（1）金納米粒子的制備：將濃度為0.003?0.005mol/L硝酸銀溶液加熱至沸騰后加入植酸鈉溶液并持續加熱至沸騰，并保持15?20min后加入濃度為0.003?0.005mol/L植酸鈉溶液，在劇烈攪拌下，加熱至沸后，快速加入質量濃度為1.5?1.8%新配制的檸檬酸三鈉溶液，連續煮沸，待溶液顏色由深藍變為紅色，即可得到紅色的金納米粒子（Au）溶液，冷卻至室溫后稀釋到100?mL，搖勻，置于4?°C冰箱中保存；（2）金納米粒子探針的制備：將5mg二茂鐵羧酸加入到10?mL?0.1?mol/L的磷酸緩沖溶液溶液中，再加入含有3?5%羅丹明B?異硫氰酸酯的熒光染料，將此混合溶液在室溫下劇烈攪拌反應2?h，離心分離去除過量的熒光染料，用牛血清白蛋白將金納米顆粒表面的活性位點進行封閉半小時，獲得可激活金納米熒光探針，4℃保存備用；（3）金電極的處理：首先將金電極在麂皮上分別用氧化鋁粉拋光，依次用乙醇和蒸餾水分別超聲8min，最后在0.1?mol/L?H2SO4溶液中進行循環伏安掃描直至電流電壓曲線穩定；在潔凈的金電極表面滴加2?μM?DNA1，在25?°C下組裝120?min，修飾了DNA1的金電極表面經充分洗凈后，用高純氮氣吹干，然后將金電極浸入1?mM?巰基己醇中，25?°C下封閉50?min；（4）三聚氰胺的測定：將10.0?μL不同濃度的三聚氰胺標準溶液或樣品溶液和10.0?μL?Au?Fc?DNA2復合物溶液滴加到修飾了DNA1的金電極表面，在室溫下反應60?min，然后，用磷酸緩沖溶液反復沖洗電極表面，除去未結合的三聚氰胺和Au?Fc?DNA2復合物，利用差分脈沖伏安法（DPV）在磷酸緩沖溶液中以100?mV/s的掃速進行掃描，電位掃描范圍為?0.7~0.1?V，根據電化學信號對三聚氰胺進行定量，（5）熒光強度的測定：將標準抗原（1pg/mL?到100ng/mL）及待測樣本溶液中加入到96?孔板孔中，并在37℃下溫育1?小時，將處理后的金電極加入到到96?孔板孔中，加入適量半胱胺（1mM），避光震搖1?分鐘后測試熒光強度。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李紅偉，
申請(專利權)人：青島藍農谷農產品研究開發有限公司，
類型：發明
國別省市：山東;37
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