水產品常見病毒檢測試劑盒制造技術

本發明專利技術涉及水產品檢測用品領域內的一種水產品常見病毒檢測試劑盒，主要由引物組合和膜芯片組成，引物組合為7重聚合酶鏈式反應引物組合，其中，反向引物的5’端接上Tag序列，引物組合中還含有一條5’端帶生物素標志的Tag引物，膜芯片為順序固定在支持膜表面的7組探針序列、1組陽性對照探針序列和1組陰性對照探針序列。本發明專利技術克服了現有水產品病毒檢測技術費時費力成本高的缺陷，提供的水產品常見病毒檢測試劑盒操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉。

【技術實現步驟摘要】
【專利說明】所屬
本專利技術涉及水產品檢測用品領域，具體為水產品常見病毒檢測試劑盒。
技術介紹
水產品是營養豐富的食品，尤其是魚類的蛋白質高、脂肪低、膽固醇少，為人們所喜食。然而，近年來，各類病毒嚴重威脅著水產品的健康可持續發展，水產品質量也因此受到嚴重影響。更為重要的是，部分水產品病毒，如甲肝病毒、諾瓦克病毒及類諾瓦克病毒會引起水產品相關疾病。水產品質量安全問題不僅關系到水產業的健康發展，也與人民群眾健康息息相關，加強水產品質量安全管理體系研究具有重大而深遠的意義。核酸檢測技術作為分子生物學檢測技術的核心，在水產品病毒檢測中發揮著巨大作用。目前市面上水產品病毒核酸檢測方法主要為常規定性聚合酶鏈式反應(PCR)，實時熒光PCR及基因芯片技術等。常規定性PCR操作簡單，但過程繁瑣，需通過瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，檢測靈敏度低，且檢測過程中使用高致癌染料，對環境及人體危害非常大。實時熒光PCR檢測靈敏度高，但其設備昂貴、對操作人員專業素質、引物及模板質量要求高，且不同品牌間產品重復性及重現性不佳。使用常規定性PCR及實時熒光PCR法每次只能篩檢一種病毒指標，無法滿足同時針對水產品中多種病毒進行篩檢的需求。而基因芯片法利用核酸雜交原理，將待測病毒特異性探針固定于固相/液相芯片上，可同時檢測多種病毒指標，但其配套設備昂貴，通常用于科研工作中。
技術實現思路
本專利技術的目的是為了克服現有水產品病毒檢測技術費時費力成本高的缺陷，提供一種操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉的水產品常見病毒檢測試劑盒。本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的: 本專利技術的水產品常見病毒檢測試劑盒，主要由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重聚合酶鏈式反應(PCR)引物組合，各對引物的堿基序列5’ -3’如下: 外參基因:正向引物:GATTTGGACCTGCGAGC 反向引物:GGTTGGCCAGGCGCGAAG ; 甲肝病毒:正向引物:ACAACTGTAAATGGAACCCC 反向引物:AGCAACATGGATGCCCAA ; 星狀病毒:正向引物:GAATTTCCTCTCCGCCTGAC 反向引物:CGGTTGTTCTCATCAGAGTCC ; 諾瓦克病毒:正向引物:ACCTAACCACCAGAACCCCTT 反向引物:CTCAGCATCCATTGTTCCAAAGCG ; 輪狀病毒:正向引物:CTTTTCCATCCGAAATTAACAC 反向引物:AATATAAGGCAACCACGGTA ; 脊灰病毒:正向引物:AGGAGAAAATTATCCCACAAGC 反向引物:AAACATACTGGTTCAATACGGTG ; 柯薩奇病毒:正向引物:AAAACGTGGCAGCTAATGGA 反向引物:GCCACTCACCATAAGCAACA ; 其中，反向引物的5’端接上Tag序列，該Tag序列為 5’ -AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3’ ； 引物組合中還含有一條5’端帶生物素標志(b1tin)的Tag引物，其堿基順序如下所示:Tag 引物:b1tin-5，-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3，； 膜芯片為順序固定在支持膜表面的7組探針序列、1組陽性對照(Positive)探針序列和1組陰性對照(Negative)探針序列，7組探針序列、陽性對照探針序列和陰性對照探針序列的堿基序列5’ -3’如下: 外參基因探針:CTGACCTGAAGGCTCT ； 甲肝病毒探針:TCCAGGAAGACCTTCGCCTT ; 星狀病毒探針:CTGTCCGCTTCATCGTCTTCGT ； 諾瓦克病毒探針:CCCAACTAATGGCCCTGCTCGGT ； 輪狀病毒探針:CAAATTTACTTCCACCGTACACA ； 脊灰病毒探針:TTCCTGACTAGGGCATGATTGGT ； 柯薩奇病毒探針:ACGGTCACTGTAACCACATGCTTC ； Positive 探針:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGA GAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG ； Negative 探針:GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCC ATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC。上述方案中，所述試劑盒主要由引物組合、膜芯片和輔料組成，輔料為dNTPs、EX-Taq聚合酶(Polymerase)及5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA，該單鏈的堿基序列為:b1tin-5’-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。上述方案中，所述試劑盒由引物組合、膜芯片、輔料和配液組成，配液為10XPCR緩沖液、預雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺(TMB)顯色液。上述方案中，所述預雜交液為5XSSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉(SDS)和lOXDenhardt’ s液，其中，SSC為0.75M氯化鈉和0.075M檸檬酸鈉，Denhardt’ s液為1% Ficoll聚鹿糖，1%聚乙稀P比略燒酮(polyvinylpyrrolidone)，1%牛血清白蛋白(BSA)；雜交液為5XSSC，0.1%重量百分比SDS，5XDenhardt’ s，50%重量百分比去離子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分別為洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液1:2XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液2:0.5XSSC和0.1%重量百分比SDS，洗液3:100 mM (毫摩爾/ 升)Tris-HCl，pH7.5，150 mM 他(:1，洗液4:100 mM Tris_HCl，pH9.5，100 mM NaCl 和 100mM MgCl2;封閉液為3%重量百分比牛血清白蛋白(BSA)，100 mM Tris-HCl，ρΗ7.5，150 mMNaCl ;四甲基聯苯胺顯色液由四甲基聯苯胺顯色液A液和四甲基聯苯胺顯色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基聯苯胺顯色液A液:pH5.4的200mM檸檬酸鈉和0.2mg/ml四甲基聯苯胺，四甲基聯苯胺顯色液B液:3%重量百分比的H202用800體積的雙蒸水稀釋液。上述方案中，所述支持膜為硝酸纖維素膜、尼龍膜或其他有三維孔徑結構的支持物。本專利技術采用多重PCR擴增的方法擴增目標序列。多重PCR擴增技術原理是將多對引物放到同一個反應管中進行PCR擴增，達到同時擴增2種或兩種以上目標DNA序列的目的。本專利技術采用了 7重PCR擴增體系擴增目標序列，包括6種常見、常檢的水產品病毒檢測指標:甲肝病毒、星狀病毒、諾瓦克病毒、輪狀病毒、脊灰病毒、柯薩奇病毒和外參基因。本專利技術采用單引物擴增獲得大量單鏈DNA技術用以提高檢測靈敏度。單引物擴增技術原理是在PCR擴增過程中采用的反向引物的5’端接上Tag序列，同時引入一條5’端帶生物素標志(b1tin)的T本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種水產品常見病毒檢測試劑盒，主要由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重聚合酶鏈式反應引物組合，各對引物的堿基序列5’?3’如下：外參基因:?正向引物:?GATTTGGACCTGCGAGC反向引物:?GGTTGGCCAGGCGCGAAG；甲肝病毒:?正向引物:?ACAACTGTAAATGGAACCCC反向引物:?AGCAACATGGATGCCCAA；星狀病毒:?正向引物:?GAATTTCCTCTCCGCCTGAC反向引物:?CGGTTGTTCTCATCAGAGTCC；諾瓦克病毒:?正向引物:?ACCTAACCACCAGAACCCCTT反向引物:?CTCAGCATCCATTGTTCCAAAGCG；輪狀病毒:?正向引物:?CTTTTCCATCCGAAATTAACAC反向引物:?AATATAAGGCAACCACGGTA；脊灰病毒:?正向引物:?AGGAGAAAATTATCCCACAAGC反向引物:?AAACATACTGGTTCAATACGGTG；柯薩奇病毒:?正向引物:?AAAACGTGGCAGCTAATGGA反向引物:?GCCACTCACCATAAGCAACA；其中，反向引物的5’端接上Tag序列，該Tag序列為5’?AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT?3’；引物組合中還含有一條5’端帶生物素標志的Tag引物，其堿基順序如下所示：Tag引物：biotin?5’?AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT?3’；膜芯片為順序固定在支持膜表面的7組探針序列、1組陽性對照探針序列和1組陰性對照探針序列，7組探針序列、陽性對照探針序列和陰性對照探針序列的堿基序列5’?3’如下：外參基因探針:?CTGACCTGAAGGCTCT；甲肝病毒探針:?TCCAGGAAGACCTTCGCCTT；星狀病毒探針:?CTGTCCGCTTCATCGTCTTCGT；諾瓦克病毒探針:?CCCAACTAATGGCCCTGCTCGGT；輪狀病毒探針:?CAAATTTACTTCCACCGTACACA；脊灰病毒探針:?TTCCTGACTAGGGCATGATTGGT；柯薩奇病毒探針:?ACGGTCACTGTAACCACATGCTTC；Positive探針:?GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG；Negative探針:?GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉凡，云振宇，孫昭，張瑤，劉貞，彭麗萍，胡太貴，鄧遠洪，黃廣平，
申請(專利權)人：四川華漢三創生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：四川;51