一種西地那非及其結構類似物的免疫檢測方法技術

本發明專利技術屬于免疫檢測技術領域，公開了一種西地那非及其結構類似物的免疫檢測方法，即以巰基西地那非半抗原制備人工抗原，再制備得到抗體，并用于檢測西地那非及其結構類似物，該方法克服了現有檢測西地那非技術的缺陷和步驟，對西地那非的最大檢測范圍為0.024～1.21ng/mL，靈敏度為0.17ng/mL，檢出限為0.008ng/mL，回收率為86.0～90.8%，該方法檢測快速、大大縮短了檢測時間，不考慮檢測人員操作熟練程度的影響，整個檢測過程僅僅需要80min左右即可完成，且檢出限更低、靈敏度更高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及免疫檢測
，更具體地，涉及一種西地那非及其結構類似物的 免疫檢測方法。
技術介紹
西地那非為roE-5抑制劑，用于治療男性勃起功能障礙，屬于處方藥。然而，一些 保健食品生產企業為突出產品的功效，違法在保健食品中添加化學藥物，如在抗疲勞產品 中非法添加枸櫞酸西地那非、他達那非、瓦地那非等，對消費者身體健康構成嚴重威脅。 目前市場的補腎壯陽類、抗疲勞類保健食品違法添加了化學藥品的現象可謂是觸 目驚心。添加的成分主要為：西地那非、他達拉非、瓦地那非，其中以非法添加西地那非較 常見。2006年3月下旬查處的7種保健食品中有2種添加西地那非，5種添加了他達拉非； 2012年山西藥監局公布的10種禁售保健食品中，7種含有TOE-5抑制劑，分別為西地那非， 他達那非；2013年1月上海公布的8種禁售的保健食品中，5種含有TOE-5抑制劑，分別為 西地那非、瓦地那非、他達那非、豪莫西地那非。與此同時，北京、江蘇無錫、安徽銅陵、江蘇 南通、南京、重慶、湖南衡陽等地的食品藥品監督部門在當地的補腎、壯陽、抗疲勞保健食品 抽檢中均檢出西地那非等TOE-5抑制劑；不僅如此，還有一些尚未被批準的西地那非的結 構類似物被非法添加在保健食品、能量飲料、中草藥中。 在不知情的情況下服用了添加西地那非及其結構類似物的保健食品極易引發毒 副作用，會出現頭暈、昏暈、甚至青光眼，造成對腎功能、心臟功能、心血管疾病的嚴重損害。 長期服用，還會導致食用者勃起不倒，傷及陰部肌肉組織，甚至加重陽痿，甚至變為永久性 陽痿。國內已有內服枸櫞酸西地那非后死亡的報道。因此對西地那非及其結構類似物建立 一種快速、有效的檢測方法顯得尤為重要。 西地那非及其結構類似物的檢測最常使用的方法為儀器分析法，沈志武等（2008) 利用高效液相色譜法測定了保健食品中他達拉非、西地那非、伐地那非的含量；他達拉非和 西地那非的檢出限為〇. 3 mg/L，伐地那非的檢出限為0. 4 mg/L，回收率為95. 8~107. 0%。 國內進出口行業標準（SN/T 1951-2007)中已把HPLC-MS法作為進出口保健食品中西地那 非、他達那非、伐地那非的檢測方法之一。該方法在片劑、膠囊劑中對三者的測定低限為1. 0 μ g/mg，回收率在83. 8~101%之間；口服溶液劑中對三者的的測定低限為0. 01 μ g/mL， 回收率在94. 5~108%之間。雖然上述幾種儀器分析法的檢測精確度高，但因其儀器化程 度高、檢測時間長、過程繁瑣、檢測費用昂貴等，從而阻礙了其推廣應用，因而通常作為實驗 室確證方法，但是無法滿足現場或者大批量的快速篩查檢測。而免疫分析法因成本低、操作 簡單、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化程度低，值得我們推廣成為常用的篩選方法，現有 技術中缺乏一種抗體同時檢測西地那非及其結構類藥物的免疫方法。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題克服現有技術存在的上述問題，提供一種西地那非及其 結構類似物的免疫檢測方法。 本專利技術的目的是通過以下技術方案予以實現的： 式（I )所示結構的物質在檢測西地那非及其結構類似物中的應用；所述西地那非的結 構類似物為瓦地那非、巰基西地那非、蒙莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、去甲西 地那非、異丙氧基硫代艾地那非、羥基豪莫西地那非、羥基巰基蒙莫西地那非、羥基硫代瓦 地那非、去乙基瓦地那非、烏地那非、巰基蒙莫西地那非、烏地那非、巰基蒙莫西地那非；所 述式（I)結構如下： 首先將巰基西地那非抗原包被于固相載體(化學發光酶標板）上，然后加入標準 品溶液或待測樣品，再加入酶標記的巰基西地那非抗體，包被抗原與待測樣品中的西地那 非及其結構類似物競爭酶標抗體，待測樣品中西地那非及其結構類似物含量高時，則與固 相抗原結合的酶標抗體就少，反之結合在固相抗原上的酶標抗體就多，反應后加入發光液 加以測定，當酶標抗體量一定時，加入的待測樣品含西地那非及其類似物越多，與固相抗原 結合酶標抗體就越少，發光反應減弱，百分發光值低，反之，則發光反應增強，百分發光值增 高，因而根據百分發光值與西地那非濃度之間的半對數關系作圖即得標準曲線，并推算出 帶刺樣品中西地那非的濃度，其他與西地那非的結構類似物是根據它們對西地那非的交叉 反應率推算其實際濃度。專利技術人通過研究發現，利用巰基西地那非制備人工抗原免疫動物 后制備得到的抗體檢測西地那非及其結構類似物時，效果更好。 本領域公知，酶聯免疫檢測方法的關鍵在于抗原和抗體的設計與選擇，以及靈敏 度的高低，而靈敏度受檢測過程中的每一個環節的制約，如何設計合適的抗原和抗體及其 制備方法，如何選擇檢測方法及協調每一步驟從而達到最優效果，是酶聯免疫檢測方法建 立的技術難題所在，本專利技術為了克服現有技術的缺陷，總結出一套優化的西地那非及其結 構類似物的直接化學發光酶聯免疫檢測方法。 本專利技術還提供式（I )所示結構的物質在制備檢測西地那非及其結構類似物的制 劑中的應用；所述西地那非的結構類似物為瓦地那非、巰基西地那非、蒙莫西地那非、那莫 西地那非、硫代艾地那非、去甲西地那非、異丙氧基硫代艾地那非、羥基豪莫西地那非、羥基 巰基蒙莫西地那非、羥基硫代瓦地那非、去乙基瓦地那非、烏地那非、巰基蒙莫西地那非、烏 地那非、巰基蒙莫西地那非；所述式（I )結構如下：(I )。 本專利技術還提供上述半抗原的制備方法，是按質量比1 :0. 8~1. 2將巰基西地那非 及無水碳酸鉀置于反應器中，用無水DMF溶解，然后加入與巰基西地那非摩爾比1 :1~1. 4 的溴乙酸甲酯反應30~40min后，終止反應，旋轉蒸干DMF，用乙醚和蒸餾水（1: 1，v/v)溶 解殘渣，萃取后即得。 具體的，所述萃取是：用乙醚和蒸餾水（1 :1，v/v)溶解殘渣后，先乙醚萃取，水層 用濃NaOH調節pH，用二氯甲烷將沉淀溶解并萃取，二氯甲烷層蒸干，得到具有黏性白色結 晶物，取該白色結晶物，用THF/H20 (3 :2)溶解，加與該結晶物摩爾比1 :1~1. 4的LiOH， 45°C反應過夜，蒸干THF，用鹽酸緩慢調節pH至4. 5,用乙酸乙酯反復萃取后將有機層蒸干 即得。 本專利技術還提供一種檢測檢測西地那非及其結構類似物的免疫檢測方法，包括以下 步驟： 51. 將具有式（II)所示分子結構的巰基西地那非人工抗原作為免疫原免疫動物制備 巰基西地那非抗體，并與標記酶結合制備得到酶標抗體； 52. 將具有式(III)所示分子結構的巰基西地那非人工抗原作為包被原包被在微孔板 上；采用直接競爭化學發光酶聯免疫法測定樣品中西地那非及其結構類似物的含量。優選地，本專利技術所述免疫檢測方法包括以下步驟： 51. 將具有式（II)所示分子結構的巰基西地那非人工抗原作為免疫原免疫動物制備 巰基西地那非多克隆抗體；采用過碘酸鈉法與辣根過氧化物酶偶聯制備辣根過氧化物酶標 記的巰基西地那非酶標抗體； 52. 將具有式(III)所示分子結構的巰基西地那非人工抗原作為包被原包被在酶標板 上； 53. 配制西地那非標準品溶液和化學發光液、濃縮洗滌液；采用直接競爭化學發光酶 聯免疫法測定樣品中西地那非類藥物的含量。 所述包被有巰基西地那非人工抗原的化學發光酶標板是96孔或40孔可拆不本文檔來自技高網...

【技術保護點】
式（Ⅰ）所示結構的物質在檢測西地那非及其結構類似物中的應用；所述西地那非的結構類似物為瓦地那非、巰基西地那非、蒙莫西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、去甲西地那非、異丙氧基硫代艾地那非、羥基豪莫西地那非、羥基巰基蒙莫西地那非、羥基硫代瓦地那非、去乙基瓦地那非、烏地那非、巰基蒙莫西地那非；所述式（Ⅰ）結構如下：（Ⅰ）。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：沈玉棟，鄧麗華，朱彬，楊金易，李瑞婷，徐振林，王弘，雷紅濤，孫遠明，
申請(專利權)人：華南農業大學，
類型：發明
國別省市：廣東;44