一株具有抗病毒活性的海洋放線菌及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一株產生抗病毒活性物質的海洋放線菌，屬于微生物技術領域。所述的放線菌為鏈霉菌(Streptomyces)HA12284，于2015年7月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理普通微生物中心，保藏號為CGMCC?No.11079。本發明專利技術所述的鏈霉菌HA12284，其發酵液對H1N1及其同一系列的H2N2、H3N2、H5N1病毒具有明顯抑制作用，對HBV、HIV也存在一定抑制，具有良好的藥物開發前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一株抗病毒的鏈霉菌屬（Streptomyces)放線菌HA12284,屬于微生物

技術介紹
病毒（Virus)是一類原始的、有生命特征的、能自我復制和嚴格細胞內寄生的非 細胞生物。作為一類主要的致病微生物，近年來病毒感染性疾病呈現快速上升趨勢，嚴重威 脅著人類健康。而目前對病毒感染缺乏特異、有效的預防和治療手段，幾乎還沒有哪種藥物 能夠真正有效的控制病毒感染，僅有為數不多的幾種藥物應用于臨床，如阿洛昔韋、齊多夫 定、阿糖腺苷、六環鳥苷、干擾素等。因此，研究特異性抗病毒藥物具有十分重要的現實意 義。流感病毒引起的流行性感冒是一種急性病毒性呼吸道傳染病，傳染速度快，尤其是H1N1 流感病毒在全世界范圍內未得到有效控制，嚴重威脅人類的生命安全。尋找新的有效的抗 病毒藥，特別是對病毒具有高度選擇性、而對宿主細胞無毒副作用的藥物是當前迫切而重 要的任務。 放線菌是自然界分布最廣泛的微生物類群之一，是微生物藥物的主要來源。目 前的微生物藥物主要由放線菌產生，如：利巴韋林是由略黃擬諾卡氏菌（Nocardiopsis flavidus)產生的間型霉素（formycin)改造的衍生物，抗皰疹病毒及乙肝病毒的阿糖腺苷 也可由放線菌產生。目前對抗病毒放線菌的研究報道相對較少，從放線菌中篩選抗病毒抗 生素仍是當前研究的熱點之一。 紅樹林生長于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶，受周期性潮水浸淹，是重要的濕地類型， 同時也是陸地向海洋過渡的特殊生態系統。該生境具有強還原性、強酸性、高含鹽量、營養 豐富等特征，蘊藏著豐富且獨特的微生物資源。從紅樹林底泥中分離的放線菌，可產生許多 重要的次生代謝產物，成為人類尋找和開發具有藥用或其他用途天然產物的重要源泉。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一株能夠產生抗病毒活性物質的鏈霉菌。 為實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案： -株能抗病毒的鏈霉菌屬（Streptomyces)放線菌HA12284,保藏號為CGMCC No.11079。 放線菌HA12284是從紅樹林根際底泥中分離得到。 放線菌HA12284具有以下微生物特性： (1)形態與培養特性 菌株HA12284在高氏一號、燕麥汁、土豆汁、酵母粉-淀粉、無機鹽-淀粉、甘油天 門冬素培養基上均生長良好。菌絲長，微曲（圖1)。基內菌絲生長豐富，淺藍色至藍黑色； 氣生菌絲絨狀，淺灰色至棕灰色；能產生淺藍色至藍黑色可溶性色素，培養特征見表1。 表1菌株HA12284的培養特征 (2)生理生化特征 菌株HA12284能利用蔗糖、D-棉子糖、D-木糖、D-葡萄糖、甘油、L-阿拉伯糖、丁 二酸、檸檬酸，不能利用L-阿拉伯糖和山梨酸，產生淀粉水解酶，產生黑色素和H2S，牛奶不 凝固不胨化，可還原硝酸鹽，纖維素上不能生長，不能使明膠液化。 (3)本專利技術所述的菌株HA12284,其16SrDNA序列在GenBank的登錄號為 JQ820204， 具體序列如下： 本專利技術涉及的菌株HA12284,經分類鑒定，確定為鏈霉菌屬的一個種，暫命名為 Streptomycessp.HA12284,已于2015年7月16日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心（CGMCC)進行了菌種保藏，并證明存活，其保藏登記號為CGMCCNo. 11079。保存 地址為北京市朝陽區北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所。 本專利技術的優點是：該菌產生的次生代謝產物對多種病毒有較強的抑制作用，尤其 對H1N1流感病毒有明顯抑制作用。 下面結合說明書附圖和【具體實施方式】對本專利技術作進一步說明。【附圖說明】 圖1為本專利技術所述菌株的菌絲及孢子絲形態，400X。【具體實施方式】 下面結合具體實施例對本專利技術作進一步說明：實施例 1:菌株HA12284CGMCCNo. 11079 的分離 底泥樣品采集于海南省東寨港紅樹林保護區，于通風櫥中風干5-7天。取5g風干 后的土壤樣品，放入無菌三角瓶中，添加45mL的滅菌海水，置于30°C、180r/min的恒溫搖床 中振蕩lh。采用平板稀釋涂布法，吸取原液lmL，用無菌海水10倍逐級稀釋，選擇適當梯度 吸取100μL，涂布于放線菌分離培養基，靜置培養于28°C的恒溫培養箱中。適時挑取形態、 顏色不同的菌落進行劃線純化。對于已純化的放線菌，根據菌落形態學特征，排除相同菌 株，轉入斜面4°C保存，編號，留作菌株篩選用。實施例 2:菌株HA12284CGMCCNo. 11079 的培養 (1)斜面培養：培養6天。培養基：可溶性淀粉10g，硝酸鉀lg，磷酸氫二鉀0. 5g， 硫酸鎂〇. 5g，硫酸亞鐵0.Olg，陳海水配制，pH7. 2。 (2)種子培養：從斜面挑取經活化的單菌落接入種子培養基，28°C、180r/min培 養48小時。培養基：葡萄糖1%，大豆粉1%，酵母膏1%，可溶性淀粉0.5%，磷酸氫二鉀 0· 025%，天然陳海水（新鮮海水靜置一周后）配制，ρΗ7· 2。 (3)發酵培養：按8%的接種量接入種子培養液，28°C、180r/min搖瓶培養6天。培 養基：葡萄糖〇. 5 %，可溶性淀粉1. 5 %，大豆粉1 %，酵母膏0. 5 %，磷酸氫二鉀0. 025 %，用 75 %天然陳海水與25 %蒸餾水配制，pH7. 2。 實施例3:菌株HA12284CGMCCNo. 11079抗H1N1病毒活性檢測 按實施例2的方法進行發酵培養，收集發酵6天的發酵產物，lOOOOr/min離心 10min，取上清液，再用0. 22μm無菌濾膜過濾，備用。 發酵液按CPE+MTT結合法進行抗H1N1病毒活性檢測：培養MDCK犬腎細胞，待細 胞長成單層后，接種H1N1病毒液50μL，37°C、5%C0J?育2h，棄上清，加入稀釋20倍的發 酵液50yL，37°C、5%C02孵育，于倒置顯微鏡下觀察試驗細胞病變（cytopathiceffect; CPE)情況。CPE的記錄方法為：無CPE為25%細胞出現病變為" + " ；25 %~50 %細胞 病變為"++" ；50 %~75 %細胞病變為"+++" ；75 %~100%的細胞病變為"++++"。待病毒 對照出現"+++~++++"時，將待檢的細胞孔棄上清，每孔加入5mg/mL的MTT溶液50μL，置 37°C孵育2h，棄上清，加入DMS0 50μL，室溫放置10min后，震蕩混勻，用酶標儀于570nm波 長下測定吸光度（A)值。50μg/mL的利巴韋林作為陽性對照，實驗設置病毒對照和細胞對 照，每一發酵液均做3個重復。根據以下公式計算病毒抑制率當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種放線菌，其特征在于所述的放線菌為鏈霉菌屬(Streptomyces)，菌株代號為HA12284，該菌株于2015年7月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC?NO.11079。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃惠琴，劉敏，鮑時翔，李逾，孫前光，朱軍，
申請(專利權)人：中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：海南;66