基于AMF為熒光素標記物的雙酚A熒光偏振免疫分析檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種基于AMF為熒光素標記物的雙酚A熒光偏振免疫分析檢測方法，旨在提供一種具有較好的特異性和靈敏度的檢測方法，該方法是利用雙酚酸BVA作為半抗原偶聯AMF熒光素合成得到熒光標記物，并以雙酚A為標準品，用雙酚A單克隆抗體作為抗體，建立雙酚A的熒光偏振免疫分析檢測方法該方法；屬于熒光偏振免疫檢測技術領域。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術公開了一種熒光偏振免疫分析檢測方法，具體地說，是一種基于AMF為熒光素標記物的雙酸A焚光偏振免疫分析檢測方法；屬于焚光偏振免疫檢測

技術介紹
雙酚A (Bisphenol A, BPA),學名為2，2_ 二(4-羥基苯基)丙烷，是重要的有機化工原料之一，主要用于生產聚碳酸酯、不飽和聚酯樹脂、環氧樹脂聚苯醚樹脂等高分子材料，適量添加雙酚A能使塑料制品擁有輕巧、耐用等特性。因此，雙酚A被廣泛應用于飲料瓶、嬰兒奶瓶、玩具、牙齒填充物等，在生產生活過程中雙酚A在強酸、強堿或高溫環境下，極易被釋放出來進入水生環境中。研究發現垃圾堆中雙酚A會從廢棄塑料制品中釋放出來，并隨之進入生態環境中。人們可通過皮膚接觸、呼吸道、消化道等途徑攝入雙酚A，雙酚A在低劑量時即具有破壞人體內環境，對DNA以及肝腎細胞造成損傷，讓人出現頭昏、頭痛、精神不安等身體不適。近年來，國內外非常重視對環境雌激素雙酚A的檢測，應用的較多為高效液相色譜法、熒光光度法、質譜聯機法等儀器方法，儀器方法檢測的靈敏度和精確性較好，但樣品前處理過程復雜，且操作費時、分析成本高。目前，基于特異性抗原抗體結合的免疫分析方法成為研究的熱點，因其具有操作簡單快速、成本低廉同時具有較高的靈敏度，符合現場環境樣本痕量監測的需要。熒光偏振免疫分析方法具有靈敏度高，適用范圍廣，不需樣品前處理，快速得出分析結果等優點，適用于大量樣本的快速篩選檢測，目前沒有基于雙酚A單克隆抗體和4-胺甲基熒光素(AMF)為熒光素標記物的熒光偏振免疫分析方法的相關報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種以4-胺甲基熒光素AMF與半抗原偶聯制得的熒光標記物的雙酚A熒光偏振免疫檢測方法，該方法具有較好的特異性和靈敏度。為解決上述技術問題，本專利技術提供的技術方案是這樣的:—種基于AMF為熒光素標記物的雙酚A熒光偏振免疫分析檢測方法，該方法是利用雙酚酸BVA作為半抗原偶聯AMF熒光素合成得到熒光標記物，并以雙酚A為標準品，用雙酚A單克隆抗體作為抗體，建立雙酚A的熒光偏振免疫分析檢測方法。進一步的，上述的基于AMF為熒光素標記物的雙酚A熒光偏振免疫分析檢測方法，該方法依次包括下述步驟:I) AMF熒光素標記物的制備:取雙酚酸，N-羥基琥珀酰亞胺，二環己基碳二亞胺，溶解于N-N 二甲基甲酰胺中，室溫避光攪拌過夜；向以上反應液中加入AMF熒光素，室溫避光攪拌反應3小時，制得BVA-AMF熒光標記物；其中:雙酚酸、N-羥基琥珀酰亞胺、二環己基碳二亞胺與AMF熒光素質量比為:8-12: 9-12: 16-20: 0.8-1.2 ； 2) AMF熒光標記物的純化:室溫下進行薄層層析分離，分離純化得到AMF熒光標記物，紫外透射儀下觀察，選擇二次分離純化的Rf= 0.99的橙黃色條帶，用甲醇洗脫萃??；3) AMF熒光標記物工作濃度的確定用0.025M、pH8.0的硼酸鹽緩沖液稀釋不同濃度的AMF標記物，取ImL稀釋液放在試管中，充分混勻，用熒光偏振儀檢測偏振光強度，以10倍空白溶液的偏振光強度作為其工作濃度，確定選取1: 12500稀釋度作為工作濃度，空白溶液選用0.025M、pH8.0的硼酸鹽緩沖液；4)雙酚A單克隆抗體工作濃度的確定首先在每個試管中加入500 μ L I: 12500稀釋度的AMF熒光標記物工作液，再分別于每個試管加入500 μ L不同稀釋度的雙酚A單克隆抗體稀釋液，充分混勻，室溫下孵育lOmin，用熒光偏振儀檢測偏振光強度值，確定選取1:200稀釋度作為抗體的工作濃度；5)競爭試驗雙酚A 用 10% PBS 緩沖液稀釋成 0、3、10、30、100、300、1000、3000、10000ng/mL 系列濃度，分別加入不同的試管中，每管20 μ L，然后向每管加入500 μ L稀釋度為1:12500的AMF熒光標記物工作液，最后向每管分別加入500 μ L稀釋為1:200的雙酚A單克隆抗體工作液，充分混勻，于室溫孵育lOmin，用熒光偏振儀檢測偏振光強度值；6)雙酚A標準抑制曲線的繪制:以抑制率mP/mPo為縱坐標，以雙酚A濃度對數值為橫坐標，作圖建立雙酚A的標準抑制對數曲線；7)實際樣品的檢測:以實際樣品按照步驟5)的方法進行檢測，測得的偏振光強度值為雙酚A的標準抑制對數曲線對照，確定樣品的雙酚A殘留量。更進一步的，上述的基于AMF為熒光素標記物的雙酚A熒光偏振免疫分析檢測方法，所述薄層層析分離時的展開液為體積比4:1:0.1的CHC13-CH30H-CH3C00H。與現有的技術相比較，本專利技術提供的技術方案中AMF具有快速偶聯半抗原，且熒光素不需要改性，本身含有的氨基具有與半抗原上已活化的羧基結合的能力，反應快速而有效。偶聯得到的熒光標記物與抗體結合能力更強，具有較高的熒光信號，比普通的FITC衍生物偶聯制備的BVA-EDF和BVA-1ysFITC的熒光信號更強。【附圖說明】圖1是不同熒光標記物與雙酚A單克隆抗體結合的能力；圖2是熒光偏振免疫分析法檢測雙酚A標準工作曲線；圖3是熒光偏振免疫分析法檢測雙酚A競爭抑制曲線；【具體實施方式】下面結合附圖和【具體實施方式】對本專利技術的權利要求做進一步詳細說明，但不構成對本專利技術的任何限制，任何人在本專利技術權利要求范圍內所做的有限次修改，仍在本專利技術的權利要求范圍內。實施例11、AMF熒光素標記物的制備稱量10.9mg雙酚酸，10.4mg N-羥基琥珀酰亞胺NHS，18mg二環己基碳二亞胺DCC，溶解于ImL的N-N 二甲基甲酰胺DMF中，室溫避光攪拌過夜；接著向以上反應液中加入Img AMF熒光素，室溫攪拌反應3小時，制得BVA-AMF熒光標記物。2、AMF熒光標記物的純化:以CHCl3 =當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于AMF為熒光素標記物的雙酚A熒光偏振免疫分析檢測方法，其特征在于，該方法是利用雙酚酸BVA作為半抗原偶聯AMF熒光素合成得到熒光標記物，并以雙酚A為標準品，用雙酚A單克隆抗體作為抗體，建立雙酚A的熒光偏振免疫分析檢測方法。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：趙肅清，寧波，劉晶，
申請(專利權)人：深圳市綠詩源生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：廣東;44