本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種GLS1和GLS2蛋白和基因的新應(yīng)用，特別是在制備肝癌診斷和預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用，具體的說本發(fā)明專利技術(shù)的目的在于提供一種基于GLS1/GLS2蛋白表達(dá)檢測、GLS1/GLS2?mRNA表達(dá)檢測的肝癌早期診斷策略和應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)包括用于肝癌診斷的GLS1/GLS2免疫組化檢測試劑盒，GLS1/GLS2熒光定量PCR檢測試劑盒。本發(fā)明專利技術(shù)檢測試劑盒提供一種GLS1/GLS2免疫組化檢測的方法。本發(fā)明專利技術(shù)檢測試劑盒提供一種GLS1/GLS2免疫組化檢測診斷肝細(xì)胞肝癌的標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明專利技術(shù)方法是通過檢測肝組織中GLS1/2mRNA、蛋白的表達(dá)變化的情況，預(yù)警肝組織的癌變是否發(fā)生及肝癌的發(fā)生發(fā)展情況，為肝癌的確診及預(yù)后、靶向腫瘤代謝的個(gè)體化治療提供必要的依據(jù)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【專利說明】GLS在制備肝癌診斷和預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用 所屬
本專利技術(shù)屬于生物
，涉及一種GLS1和GLS2蛋白的應(yīng)用，具體地說，涉及 GLS1和GLS2蛋白在制備肝癌診斷和預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
肝細(xì)胞癌（肝癌）是我國常見的惡性腫瘤。治療仍以手術(shù)為主，但臨床上90%的 肝癌患者在被診斷為肝癌的時(shí)候，已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會。而且，肝切除術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)率高達(dá) 80%，長期存活率仍然不高。早期診斷是提高術(shù)后生存期的最重要的策略。因此，肝癌急需 早期診斷和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)預(yù)測的標(biāo)記物，提高肝癌的診斷率、手術(shù)率、和長期生存時(shí)間。 血清甲胎蛋白AFP升高與腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，但約有40%的患者AFP為陰性，且與預(yù)后 無正相關(guān)。迄今為止，尚無確定的蛋白標(biāo)記能夠較準(zhǔn)確地診斷或預(yù)示腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，也沒有 評價(jià)肝癌預(yù)后的指標(biāo)。因此本領(lǐng)域迫切需要尋找能協(xié)助肝癌早期診斷和預(yù)測肝癌病情及預(yù) 后的相關(guān)基因和/或蛋白，這方面的研究對臨床治療肝癌及預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)具有重要意義。 腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)其快速增殖的需要對其新陳代謝過程重編程產(chǎn)生了兩個(gè)重要代 謝途徑-有氧糖酵解（Aerobic Glycolysis)和谷氨酰胺酵解（Glutaminolysis)。腫瘤 細(xì)胞即使在氧充足的條件下也將大部分的葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，為其快速增殖提供充足的能 量。但這也使得進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCAcycle)的丙酮酸比例減少，致使細(xì)胞合成代謝的原料 和中間產(chǎn)物不充足。為了彌補(bǔ)這種不足，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生了一個(gè)替代途徑來補(bǔ)充這些中間產(chǎn) 物，也就是谷氨酰胺酵解（Glutaminolysis)。谷氨酰胺由谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS) 水解轉(zhuǎn)變成谷氨酸，并且進(jìn)一步被谷氨酸脫氫酶（Glutamatedehydrogenase,⑶Η)催化產(chǎn) 生α -酮戊二酸（α -ketoglutarate,a-KG)，進(jìn)入三羧酸循環(huán)（TCAcycle)，進(jìn)而維持細(xì)胞 代謝中間產(chǎn)物的充足，從而形成一個(gè)以谷氨酰胺為原料進(jìn)入三羧酸循環(huán)的補(bǔ)充代謝流，稱 之為谷氨酰胺酵解。谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS)是谷氨酰胺酵解過程的關(guān)鍵限速酶， 已有研究表明靶向GLS能夠有效的殺傷腫瘤細(xì)胞。 在人類細(xì)胞中有兩種類型的谷氨酰胺酶，即由2號染色體編碼的GLS1和由12號 染色體編碼的GLS2。GLS1最早發(fā)現(xiàn)于腎臟（kidney-type)，隨后發(fā)現(xiàn)也表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中， 如人類B淋巴細(xì)胞瘤，乳腺癌，胰腺癌，膠質(zhì)細(xì)胞瘤等腫瘤細(xì)胞中GLS1表達(dá)量或活性和正常 組織相比明顯增加，在大鼠和人肝癌（小樣本）中也較正常肝細(xì)胞高。GLS1基因編碼的蛋 白有GAC(GlutaminaseC)，KGA(kidneyGlutaminaseisoform)等；GLS2 是 2010 年發(fā)現(xiàn)的 一種肝型（liver-type)的腫瘤抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)，GLS2在肝癌組織中的表達(dá)量明顯低 于正常肝組織。 我們前期臨床研究發(fā)現(xiàn)：在450例肝癌組織和200例其它肝疾病組織中，GLS1在 450例肝癌組織中的陽性率高90 %，診斷肝癌的敏感性高達(dá)87. 2 %，特異性高達(dá)74. 86 % ; 有趣的是，GLS2的表達(dá)呈現(xiàn)出與GLS1表達(dá)完全相反的趨勢。進(jìn)一步我們追蹤了 90例患者 發(fā)現(xiàn)，GLS1表達(dá)水平與患者的復(fù)發(fā)和預(yù)后相關(guān)，即GLS1高表達(dá)患者生存時(shí)間顯著縮短。上 述研究結(jié)果提示，谷氨酰胺酶GLS1和GLS2可能是一種潛在的肝癌生物標(biāo)記。目前，世界上尚未有將谷氨酰胺酶GLS1和GLS2作為肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)記的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供GLS1和GLS2蛋白和基因的新應(yīng)用，特別是在制備肝癌診 斷和預(yù)后評估試劑盒中的應(yīng)用。 本專利技術(shù)提供一種基于GLS1/GLS2蛋白表達(dá)檢測、GLS1/GLS2mRNA表達(dá)檢測的肝癌 早期診斷方法和應(yīng)用。該方法和應(yīng)用主要包括： (1)提供診斷試劑盒臨床檢測所需的試劑以及可靠操作流程。 (2)臨床可疑肝癌病例采取本診斷試劑盒檢測，進(jìn)行診斷和預(yù)后評估。 (3)提供一種基于GLS1和GLS2蛋白表達(dá)檢測、GLS1和GLS2mRNA表達(dá)檢測的肝 癌早期診斷標(biāo)準(zhǔn)。 (4)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證肝癌和其他肝臟疾病組織中GLS1和GLS2蛋白免疫組織化學(xué) 檢測、GLS1和GLS2mRNA熒光定量PCR檢測的情況。 (5)選擇高敏感性GLS1和GLS2抗體、GLS1和GLS2弓丨物。 本專利技術(shù)包括用于肝癌診斷的GLS1免疫組織化學(xué)檢測試劑盒，GLS1和GLS2免疫組 織化學(xué)檢測試劑盒，GLS1熒光定量PCR檢測試劑盒，GLS1和GLS2熒光定量PCR檢測試劑 盒。 本專利技術(shù)試劑盒提供一種GLS1和GLS2免疫組織化學(xué)檢測的方法。本專利技術(shù)試劑盒提 供一種GLS1和GLS2免疫組化檢測診斷肝細(xì)胞肝癌的標(biāo)準(zhǔn)。本專利技術(shù)試劑盒包括試劑A，試劑 B，試劑C，試劑D，試劑E和試劑F。 本專利技術(shù)試劑盒提供一種GLS1/GLS2熒光定量PCR的檢測方法。本專利技術(shù)試劑盒包括 特異性引物：GLS1的引物：其序列為上游SEQIDN0. 1，下游SEQIDNO. 2 ;GLS2的引物：其 序列為上游SEQIDNO. 3,下游SEQIDNO. 4;內(nèi)參基因GAPDH的引物，其序列為上游SEQID NO. 5,下游SEQIDNO. 6;序列詳細(xì)堿基對見序列表。 本專利技術(shù)所述的檢測方法，其特異性特征是，所述的樣本均來自肝癌病人肝組織中 癌組織及遠(yuǎn)離癌巢的正常組織。 本專利技術(shù)的試劑盒為一種通過對組織或細(xì)胞提取總RNA，并通過逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得 到cDNA，再結(jié)合熒光定量PCR檢測技術(shù)，準(zhǔn)確的檢測標(biāo)本中GLS1和GLS2mRNA的表達(dá)量的 試劑盒。 本專利技術(shù)方法是通過檢測肝組織中GLS1和GLS2mRNA的表達(dá)變化量，預(yù)警肝組織的 癌變是否發(fā)生及肝癌的發(fā)生發(fā)展情況，為肝癌的確診及診治過程提供重要信息。 本專利技術(shù)具有如下的有益效果： 本專利技術(shù)的臨床意義是跟蹤檢測肝臟癌變的發(fā)生和病理演變過程中GLS1和GLS2蛋 白、mRNA表達(dá)變化，預(yù)警肝癌發(fā)生發(fā)展趨勢。 本專利技術(shù)的GLS1和GLS2與臨床上其它癌癥標(biāo)志物，以及影像學(xué)檢查有顯著不同。 本專利技術(shù)可以在基因轉(zhuǎn)錄水平檢測GLS1和GLS2基因的異常表達(dá)。在影像學(xué)檢查發(fā) 現(xiàn)占位性癌病灶之前，及時(shí)檢測到GLS1和GLS2基因的表達(dá)異常，提供一種肝癌早期篩查、 早期診斷、早期治療的方法和應(yīng)用，為肝癌患者脫離病痛提供極有前景的策略。 本專利技術(shù)中的GLS1和GLS2抗體、GLS1和GLS2引物檢測試劑盒為肝癌及其他癌癥 的基礎(chǔ)研究和臨床研究提供了良好的工具。 本專利技術(shù)中GLS1和GLS2的表達(dá)與肝癌患者預(yù)后明顯相關(guān)，對判斷肝癌患者預(yù)后具 有重要作用；對肝癌病人術(shù)后隨訪和序貫治療具有重要的指導(dǎo)意義。 本專利技術(shù)中提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單的特點(diǎn)，不僅可以在大 中型醫(yī)院推廣，也可以在基層醫(yī)院中廣泛使用。 本專利技術(shù)的其他具體優(yōu)點(diǎn)和效果將在下面繼續(xù)說明。【附圖說明】： 圖1GLS1和GLS2在肝癌組織中的分布與表達(dá) 免疫組織化學(xué)與熒光定量PCR兩種方法檢測112對肝癌組織和癌旁組織中GLS1、 GLS2蛋白的分布與表達(dá)情況，蘇木精-伊紅染色（HEstaining)判定組織病理分類。圖1A 是免疫組織化學(xué)本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
GLS1基因在制備肝癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：余德才，丁義濤，魏繼武，史先彪，孟剛，
申請(專利權(quán))人：南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32
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