一種生物法降解煙草浸出液中甾醇類化合物的方法技術

本發明專利技術公開了一種生物法降解煙草浸出液中甾醇類化合物的方法：通過培養基從煙草表面分離甾醇降解菌，利用種子培養基擴大培養該微生物，搜集對數期細胞，接種于煙草浸提液，發酵。本發明專利技術從煙葉表面分離獲得降解甾醇的微生物，利用種子培養基進行擴大后獲得對數期細胞，添加到煙草浸提液中可以有效降解其中的甾醇含量，甾醇總降解率達到35.5%。甾醇為煙草有害物質苯并芘的前體化合物，該發明專利技術為煙草生物減害提供參考，具有很高的原創性，有望應用于降低苯并芘的再造煙葉生產過程。

【技術實現步驟摘要】
一種生物法降解煙草浸出液中甾醇類化合物的方法
本專利技術屬于煙草生物
，具體涉及一種利用生物法降解煙草中甾醇類有害化合物的方法。
技術介紹
甾醇屬于大分子醇類，是一類廣泛存在于自然界中的甾族化合物，主要存在于動植物的脂肪或油類中，或以高級脂肪酸的酯存在于動物體內或者苷的形式存在于植物的組織中。其基本骨架結構為環戊氫化菲體系，由三個六元環和一個五元環組成(如下圖所示)，C-3、C-11位上可能有烴基或酮基，C-10、C-13位上各有一個甲基，C-17位上有8～10個碳原子組成的側鏈。甾醇是煙草植物中的一類激素類物質，對煙草生長有促進作用。煙草中甾醇主要包括豆甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇以及膽甾醇等4種化合物，在煙草中的含量約為0.1-0.3％，其中豆甾醇的含量最高。煙草甾醇主要存在于煙草細胞膜中，以游離態和結合態兩種形式存在，結合態包括與脂肪酸結合形成酯，以及與糖類形成糖苷鍵的配糖類物質以及?；涮穷惢衔铩２煌a地煙葉中植物甾醇含量分布呈現出明顯的地域差異，不同部位的煙葉葉片甾醇的含量也不同，中部葉含量最大，上部葉次之，下部葉含量最少。甾醇類物質在煙草植物成熟之后對煙草品質沒有多少貢獻，反而是煙氣中稠環芳烴類物質的最為主要前體化合物，稠環芳烴已經確認為致癌物質。已有大量研究報道煙草燃燒過程中，甾醇母核經過高溫裂解可形成對人體有害的多環芳烴，包括致癌物質苯并(a)芘。因此降解煙草制品中的甾醇含量可以有效降低卷煙主流煙氣中的PolycyclicAromaticHydrocarbons(PAHs)的釋放，從而有效控制煙草對人體健康的危害。由此可見，甾醇類化合物降解轉化對減少煙氣毒害，提高煙草品質具有十分重要作用，因此，在煙草調制、陳化及煙草薄片加工過程中有效降解甾醇，對于提高卷煙的安全性具有重要價值。類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)的細菌為土壤中常見的細菌，也是一類重要的病害生物防治微生物。該菌屬也可從一些植物體內分離到。現有離體實驗表明，類芽孢桿菌在抑制植物病原菌增強植物抗病能力方面有很強作用，同時還有研究者發現，該菌屬對甾醇類化合物的生物降解有重要作用。目前已有部分研究報道，采用有機溶劑萃取法降低煙草中的游離甾醇含量來降低主流煙氣中的PAHs的釋放量。但是利用萃取法去除煙草中甾醇類化合物的效果不是很理想，同時可能會導致煙草中一些重要香味物質和潛稥物質的散失。應用生物技術降解煙草中部分有害物質的方法在近年來得到了一定的發展，然而關于煙草中甾醇類化合物的生物降解技術的相關研究卻寥寥可數。
技術實現思路
本專利技術提供一種生物法降解煙草浸出液中甾醇類化合物的方法。根據本專利技術可從煙草表面分離可降解甾醇菌株——類芽孢桿菌，并利用正交實驗(不同溫度、pH、不同生長階段細胞)確定該菌株降解甾醇的最適條件。本專利技術中類芽孢桿菌降解甾醇類化合物，具有一定的選擇性，同時整個過程簡單且快速，可為生物法降解煙草中苯并芘的有害前提物質的開發提供參考，同時在煙草減害領域具有重要的應用前景。為實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案：一種生物法降解煙草浸出液中甾醇類化合物的方法：通過培養基從煙草表面分離甾醇降解菌，利用種子培養基擴大培養該微生物，搜集對數期細胞，接種于煙草浸提液，發酵。它的步驟如下：(1)降甾醇微生物的分離：用無菌水洗滌煙葉表面2-3次，收集沉淀，將沉淀用15mlpH7.0的磷酸緩沖液稀釋后，按照10％接種量接種到分離培養基中，37℃搖床中，150r/min培養，于富集培養基中富集培養3次后，取200μl培養液涂于固體平板上，培養48h后獲得可降解甾醇的微生物單菌落；(2)微生物擴大培養：挑取步驟(1)中的單菌落到種子培養基中，于37℃搖床中，150r/min培養48小時，獲得種子培養液，保存于4℃，同時取0.5ml菌液加0.5ml的50％甘油混勻后保存于-20℃；(3)以步驟(2)中的種子培養液為種子，重新取1ml接種到50ml新鮮的種子培養液中，相同條件下培養48小時，每隔5小時取2ml菌液，測定OD值，在18-52h收集細胞，分別在6000轉，4℃下離心30min，去掉上清液；(4)甾醇降解條件：收集18-52h的細胞，并以質量1：50的比例將干細胞加入到煙草浸提液中，置于37℃的搖床中，150r/min下發酵2-8h。所述步驟(1)中分離培養基的組分：以分離培養基總量1L計，豆甾醇2.0±0.1g；葡萄糖2.0±0.1g；失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚1±0.1ml；檸檬酸2.0±0.1g；K2HPO40.5±0.01g；NH4Cl1.0±0.1g；余量為水。所述步驟(1)中富集培養基的組分：以富集培養基總量1L計，豆甾醇，5.0±0.1g；tween80，1±0.1ml；檸檬酸，2.0±0.1g；檸檬酸鐵胺，0.05±0.01g；K2HPO4，0.5±0.1g；NH4Cl，1.0±0.1g；余量為水。所述步驟(3)中的種子培養液的組分：以種子培養液總量1L計，K2HPO4，0.5±0.01g；NH4NO3，2.0±0.1g；檸檬酸，2.0±0.1g；甘油，10.0±0.2g；余量為水，pH＝7.0-7.2。本專利技術的有益效果：從煙葉表面分離獲得降解甾醇的微生物，利用種子培養基進行擴大后獲得對數期細胞，添加到煙草浸提液中可以有效降解其中的甾醇含量，甾醇總降解率達到35.5％。甾醇為煙草有害物質苯并芘的前體化合物，該專利技術為煙草生物減害提供參考，具有很高的原創性，有望應用于降低苯并芘的再造煙葉生產過程。附圖說明圖1為微生物細胞的生長曲線；圖2為標準樣品中的甾醇液相質譜圖；圖3為煙草浸提液中的甾醇液相質譜圖。具體實施方式一種生物法降解煙草浸出液中甾醇類化合物的方法，它的步驟如下：(1)降甾醇微生物的分離：煙葉來源于河南襄縣，將煙葉去梗后，葉片剪成2cm*2cm的小葉片，用無菌去離子水洗滌2次，收集沉淀，用15mlpH7.0的磷酸緩沖液稀釋沉淀，按照10％接種量接種到分離培養基中，37℃搖床中，150r/min培養，富集培養2次后，取200μl培養液涂于固體平板上，培養48h后獲得可降解甾醇的微生物單菌落。所述分離培養基的原料為：豆甾醇7412.1g；失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚(tween80)0.9ml；檸檬酸2.1g；K2HPO40.4g；NH4Cl1.1g；加水到0.9L。(2)微生物擴大培養：挑取步驟(1)中的單菌落到種子培養基中，于37℃搖床中，150r/min培養48小時，獲得種子培養液，保存于4℃，同時取0.5ml菌液加0.5ml的50％甘油混勻后保存于-20℃。所述種子培養基的成分為：K2HPO40.6g、NH4NO32.1g、檸檬酸1.9g、甘油9.9g、加水到1.1L，pH＝7.0-7.2。(3)以步驟(2)中的種子培養液為種子，重新取1ml接種到50ml新鮮的種子培養基中，相同條件下培養48小時，每隔5小時取2ml菌液，測定OD值，繪制細胞生長曲線，見圖1。在不同的生長階段(初期(18h)、對數期(36h)以及后期(52h))收集細胞，分別在6000轉，4℃下離心30min，去掉上清液。(4)微生物降解甾醇條件優化：利用正交實驗設置3個不同培養溫度：30℃、37℃、42℃；3個不同的pH本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種生物法降解煙草浸出液中甾醇類化合物的方法，其特征在于：通過培養基從煙草表面分離甾醇降解菌，利用種子培養基擴大培養該微生物，搜集對數期細胞，接種于煙草浸提液，發酵。

【技術特征摘要】
1.一種生物法降解煙草浸出液中甾醇類化合物的方法，其特征在于：通過培養基從煙草表面分離甾醇降解菌，利用種子培養基擴大培養該微生物，搜集對數期細胞，接種于煙草浸提液，發酵；步驟如下：(1)降甾醇微生物的分離：用無菌水洗滌煙葉表面2-3次，收集沉淀，將沉淀用15mlpH7.0的磷酸緩沖液稀釋后，按照10％接種量接種到分離培養基中，37℃搖床中，150r/min培養，于富集培養基中富集培養3次后，取200μl培養液涂于固體平板上，培養48h后獲得可降解甾醇的微生物單菌落；(2)微生物擴大培養：挑取步驟(1)中的單菌落到種子培養基中，于37℃搖床中，150r/min培養48小時，獲得種子培養液，保存于4℃，同時取0.5ml菌液加0.5ml的50％甘油混勻后保存于-20℃；(3)以步驟(2)中的種子培養液為種子，重新取1ml接種到50ml新鮮的種子培養液中，相同條件下培養48小時，每隔5小時取2ml菌液，測定OD值，在18-52h收集細胞，分別在6000轉，4℃下離心30min，去掉上清液；(4)甾醇降解條件：收集18-52h的細胞，并以質量...

【專利技術屬性】
技術研發人員：葉建斌，楊雪鵬，郝輝，閆記，劉向真，楊宗燦，馬科，毛多斌，
申請(專利權)人：鄭州輕工業學院，
類型：發明
國別省市：河南;41