本發明專利技術公開了一種特定基因片段的DNA甲基化檢測方法本方法，通過商業試劑盒法提取生物樣品的基因組DNA，經重亞硫酸鹽轉化后，采用聚合酶鏈反應技術獲得特定基因片段。采用化學裂解法或酶解法處理目的基因片段產物，使其從鏈狀序列裂解成單個堿基或核苷。采用內標法，通過液相串聯質譜(LC-MS/MS)檢測胞嘧啶和腺嘌呤或其核苷的含量，并根據公式計算目的基因片段的甲基化率。本發明專利技術公開的方法可以實現快速、高效、準確地對特定基因片段的DNA甲基化水平進行定量檢測。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術設及一種生物（人、動物等）樣品全基因組中特定基因片段的DNA甲基化 水平檢測方法。
技術介紹
特定基因的DNA甲基化定量分析對癌癥研究和診斷具有重要的意義，結合亞硫酸 氨鹽處理的測序法度isulfite sequencingPCR，BS巧被公認為是甲基化分析的金標準。 該方法的基本過程是：DNA經亞硫酸氨鹽處理后，未甲基化的胞喀晚脫氨基轉變成尿喀晚， 而甲基化的胞喀晚保持不變，經PCR擴增，甲基化的胞喀晚擴增為鳥嚷嶺，而尿喀晚擴增為 胸腺喀晚。對PCR產物進行克隆后測序，通過與基因庫的序列比較和數據統計分析，可判斷 CpG位點是否發生甲基化及甲基化程度的信息。此方法是一種可靠性及準確度均較高的方 法，既可W獲得特定基因的甲基化位點，又可W獲得該基因的甲基化定量的數據。但該分析 方法周期長，擴增出PCR產物后，經轉染質粒和大腸桿菌培養，挑選質粒測序，分析一個樣 品約需3-7天的時間。為了獲得離散性較小的分析結果，需要較多數量的克隆測序（一般 > 10個克隆），否則會因挑選克隆的不同，分析結果差異大，然而大量克隆測序會帶來巨大 的工作量和高昂的費用，因而影響了該方法的推廣應用。 Herman等人提出的甲基化特異PCR(Methylation-specificPCR，MS巧是目前應 用較廣的一種特定區域DNA甲基化檢測技術，可W檢測多個CpG位點的甲基化情況。該方法 W亞硫酸氨鹽處理后的DNA產物作模板，加入甲基化特異性的引物或未甲基化的引物進行 特異性的擴增檢測。若用甲基化特異性引物能擴增片段，說明該檢測位點發生了甲基化；若 用未甲基化引物能擴增出片段，說明該檢測位點未甲基化。該方法分析過程相對簡單，靈敏 度較高。但存在明顯的不足：①如果亞硫酸氨鹽對DNA處理不完全，易導致假陽性；②MSP 法是W引物中所有CpG位點胞喀晚均完全甲基化或完全未甲基化為前提設計的，而事實上 CpG島的CpG位點可能部分甲基化。所WMSP法常常存在目標片段難擴增，或者特異性差等 問題。 除了MSP,還有甲基化敏感性高分辨率溶解曲線分析（methylation-sensitive hi曲resolutionmeltinganalysis,MS-HRM),甲基化敏感性限制性內切酶消化 (methylation-sensitiverestrictendonucleasedigestion，MS-RED)和實時巧光定量 PCR,單分子實時測序（single-moleculereal-timesequencing,SMRT)等方法相繼被提 出。運些方法均存在受基因片段長度和CpG位點的限制、低靈敏度、低準確度、半定量、成本 高等不足，無法有效簡便地對特定區域DNA甲基化進行準確定量。 由于其高靈敏度和準確度，質譜（M巧已被用于區域DNA甲基化檢測，如聯合甲基 化敏感性限制性內切酶的質譜法（Combinationofmeth}dated-DNAprecipitationand methylation-sensitiverestrictionenzymesandmassspectrometry，COMPARE-MS)、 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assistedlaserdeso;rpti〇]Vionization timeoffli曲tmassspectrometry,MALDI-TOFHVB)等方法相繼被提出。但是，它們均為 半定量方法，而且數據處理復雜，難w適用臨床的常規檢測應用。 因此，有必要對現有的特定基因片段的DNA甲基化水平的定量檢測方法進行進一 步的改進。
技術實現思路
為了彌補現有技術的不足，本專利技術提供了一種特定基因片段的DNA甲基化檢測方 法，該方法可W實現快速、高效、準確地對特定基因片段的DNA甲基化水平進行定量檢測。 為了實現上述專利技術目的，本專利技術采用的技術方案如下： 一種特定基因片段的DNA甲基化檢測方法，其特征在于，采用質譜、光譜、電化學 或巧光定量PCR技術直接測定裂解后的單個堿基或核巧含量，并通過公式計算樣品中的 DNA甲基化水平。 優選地，本專利技術按照W下步驟進行： 1)DNA提取和重亞硫酸鹽處理； 2)特定基因片段的獲取重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA為模板，采用聚合酶 鏈式反應、即PCR技術擴增特定基因片段，并通過瓊脂糖凝膠電泳切膠純化特定基因片段 的PCR產物； 3)基因DNA片段的裂解：將純化后的特定基因片段的PCR產物和同位素內標準混 合，采用甲酸進行裂解反應，使基因片段裂解成為單個堿基； 4)采用液相串聯質譜LC-MS/MS檢測單個堿基或核巧的含量；[001引W特定基因片段DNA甲基化率的計算：采用公式計算目的基因片段的DNA甲基化 率。 優選地，本專利技術還可W按照W下步驟進行： 1)DNA提取和重亞硫酸鹽處理； 2)特定基因片段的獲取重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA為模板，采用聚合酶 鏈式反應、即PCR技術擴增特定基因片段，并通過瓊脂糖凝膠電泳切膠純化特定基因片段 的PCR產物； 如基因DNA片段的酶解：采用DNA裂解酶、堿性憐酸酶和核酸內切酶處理目的基 因片段，得到單個核巧。 4)采用液相串聯質譜LC-MS/MS檢測單個核巧的含量；[002U5)特定基因片段DM甲基化率的計算：采用公式計算目的基因片段的DM甲基化 率。 其中，所述液相串聯質譜用于分離和檢測DNA水解的堿基或核巧的含量。其中，所述公式如下： 其中：Peuacyt Μ為LC-MS/MS法檢測基因PCR產物中鳥嚷嶺和切t或核巧占總堿基或 核巧的百分比；Qcyt Μ和QAde Μ為LC-MS/MS法檢測基因PCR產物中切t和Ade或核巧的摩爾 量；Pgua D和PCyt CpG D分別為未經亞硫酸鹽處理的原始目的片段序列中Gua和CpG位點中的 切t或核巧占總體堿基的百分比。 本方法通過商業試劑盒法提取生物樣品的基因組DNA，經重亞硫酸鹽轉化后，采用 聚合酶鏈反應技術獲得特定基因片段。采用化學裂解法或酶解法處理目的基因片段產物， 使其從鏈狀序列裂解成單個堿基或核巧。采用內標法，通過LC-MS/MS檢測胞喀晚和腺嚷嶺 或核巧的含量，并根據公式計算目的基因片段的甲基化率。本專利的核屯、在于采用質譜、光 譜、電化學或巧光定量PCR技術直接測定裂解后的堿基A、T、G、C(測2種、3種或4種堿基 均可）或核巧含量，并通過自己推導的公式計算樣品中的DNA甲基化水平。 與現有的特定基因片段DNA甲基化檢測方法相比，本專利技術的有益效果在于：一是 準確度高。本方法W液相串聯質譜為檢測手段，具有靈敏度高、全定量的特點，可W實現任 何生物樣品，包括復雜的混合樣品中特定基因片段DNA甲基化水平的準確定量。二是效率 高。本方法避免了一系列的DNA克隆和測序的繁瑣步驟，大大提高了DNA甲基化檢測的效 率。借助全自動的LC-MS/MS儀器，重亞硫酸鹽處理和PCR之后的分析程序可在3至4小時 內完成，一天內可實現72至96個生物樣品的檢測。因此，本方法適合用于DNA甲基化的 高通量分析W及臨床快速篩查。Ξ是應用性良好。只需通過PCR成功擴增特定基因片段， 無論基因序列的長短還是CpG位點含量的高低，本方法均可準確本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種特定基因片段的DNA甲基化檢測方法，其特征在于，采用質譜、光譜、電化學或熒光定量PCR技術直接測定裂解后的單個堿基或核苷含量，并通過公式計算樣品中的DNA甲基化水平。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡春，葉曉霞，張立堅，黃瓊林，張俊杰，陳光照，
申請(專利權)人：廣東醫學院，
類型：發明
國別省市：廣東;44
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