一種提高水稻苗期耐缺鐵性的方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種提高水稻苗期耐缺鐵性的方法，本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)將含有組成型啟動(dòng)子和OsRSI基因的重組載體轉(zhuǎn)化水稻，得到的轉(zhuǎn)基因水稻在苗期的缺鐵狀態(tài)下耐受性更高。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)能夠有效解決水稻在苗期的缺鐵狀態(tài)下體內(nèi)鐵利用的技術(shù)難題。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)設(shè)及水稻育種
，特別設(shè)及。
技術(shù)介紹
鐵是植物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在植物的光合作用、呼吸作用、蛋白質(zhì)和核酸的合成等 諸多生理代謝過(guò)程的電子傳遞鏈或酶促反應(yīng)中發(fā)揮著極為重要的作用。同時(shí)，鐵又作為許 多重要酶和蛋白質(zhì)的活性中屯、或輔基參與了生命活動(dòng)中最基本的生化反應(yīng)。 ±壤中總鐵含量很高，但可被植物吸收利用的有效鐵含量卻很低。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中， 由于±壤中可被吸收利用的可溶性鐵含量不足使得植物出現(xiàn)缺鐵失綠癥，并導(dǎo)致農(nóng)作物的 大面積減產(chǎn)，及其品質(zhì)的極大影響。水稻作為重要的糧食作物之一，為世界一半W上的人口 提供了食物來(lái)源。而水稻在幼苗期容易發(fā)生缺鐵，在植株的葉片上表現(xiàn)為失綠，開(kāi)始幼葉葉 脈之間失綠黃化，葉脈保持綠色，之后完全失綠變白，有時(shí)整片葉片就變黃色。因此，改善和 提高水稻的耐缺鐵性尤為必要。 高等植物在缺鐵條件下有兩種吸收鐵的策略。雙子葉植物通過(guò)氧化還原的策略I 來(lái)吸收鐵。禾本科植物通過(guò)策略II吸收鐵，即植物的根系向外分泌麥根酸類(lèi)（MAs)天然塞 合劑，形成鐵塞合物，然后經(jīng)根部細(xì)胞膜中特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。鐵一旦被根系吸收 后，就會(huì)進(jìn)入木質(zhì)部向地上部運(yùn)輸。鐵也在植物初皮部中運(yùn)輸。不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白W及各種 有機(jī)馨合劑等在體內(nèi)鐵的運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。 通過(guò)生理生化及分子生物學(xué)水平的研究，已經(jīng)鑒定了水稻體內(nèi)有機(jī)酸馨合劑合成 途徑各催化酶的基因，和不同的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。盡管在缺鐵脅迫下運(yùn)些基因的協(xié)同表達(dá)增強(qiáng)， 有可能會(huì)改善與促進(jìn)水稻對(duì)鐵的吸收，但是，由于±壤中的鐵大部分W不溶狀態(tài)存在，且堿 性±壤或秩板上大量施用草木灰、石灰等堿性肥料，使±壤中的亞鐵離子與堿性物質(zhì)起反 應(yīng)而沉淀；此外砂質(zhì)±壤半旱育秩的秩苗期，亞鐵離子被氧化為秩苗不能吸收到的高價(jià)鐵 離子，更容易造成秩苗無(wú)法吸收到足夠的鐵而出現(xiàn)缺鐵失綠的癥狀。因而，通過(guò)技術(shù)手段促 進(jìn)水稻對(duì)鐵吸收之外，改善和提高水稻體內(nèi)對(duì)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)再利用，使得水稻在苗期耐缺鐵性 得W增強(qiáng)則顯得尤其重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供，能夠有效解決水稻在 苗期的缺鐵狀態(tài)下體內(nèi)鐵利用的技術(shù)難題。 本專(zhuān)利技術(shù)解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是： -種提高水稻苗期耐缺鐵性的方法，通過(guò)將水稻OsRSI基因?qū)肽康乃荆沟?水稻耐缺鐵性得W增強(qiáng)。 作為優(yōu)選，將水稻OsRSI基因?qū)肽康乃镜木唧w步驟如下： (1)水稻OsRSI基因獲得：取缺鐵處理的水稻幼苗的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄法合成 cDNA，并W此cDNA為模板，在引物對(duì)的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得水稻OsRSI基因； 似植物表達(dá)載體的構(gòu)建：將水稻OsRSI基因連接到質(zhì)粒載體上，獲得包含 CaMV35S啟動(dòng)子和水稻OsRSI基因的植物表達(dá)載體； (3)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得：將步驟（2)獲得的植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，采用農(nóng)桿菌 介導(dǎo)法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，培養(yǎng)后獲得耐缺鐵性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻。所 述培養(yǎng)包括共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)和分化培養(yǎng)，共培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基參見(jiàn)實(shí)施例 部分記載。 作為優(yōu)選，水稻OsRSI基因的核巧酸序列見(jiàn)SEQIDNO. 1所示。 作為優(yōu)選，步驟（1)的引物對(duì)包括祀-F和祀-R，祀-F序列見(jiàn)SEQIDNO. 2所示， 祀-R序列見(jiàn)沈QIDNO. 3所示。 作為優(yōu)選，步驟（2)所述質(zhì)粒載體為PCAMBIA1300質(zhì)粒載體。PCAMBIA1300質(zhì)粒載 體本身帶有CaMV35S啟動(dòng)子。 一種含有SEQIDNO. 1所示序列的水稻OsRSI基因的植物表達(dá)載體。 -種含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌。 本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果是：本專(zhuān)利技術(shù)將含有組成型啟動(dòng)子（CaMV35S啟動(dòng)子）和OsRSI基 因的重組載體轉(zhuǎn)化水稻，得到的轉(zhuǎn)基因水稻在苗期的缺鐵狀態(tài)下耐受性更高。本專(zhuān)利技術(shù)能夠 有效解決水稻在苗期的缺鐵狀態(tài)下體內(nèi)鐵利用的技術(shù)難題。【附圖說(shuō)明】 圖1為包含CaMV35S啟動(dòng)子和OsRSI基因的植物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2為轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型對(duì)照的OsRSI基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況的定量RCR檢 測(cè)。 圖3為轉(zhuǎn)基因水稻植株提高耐缺鐵能力。A，轉(zhuǎn)基因植株和野生型對(duì)照的生長(zhǎng)情 況；B，轉(zhuǎn)基因植株和野生型對(duì)照的莖葉高度變化；C，轉(zhuǎn)基因植株和野生型對(duì)照的葉綠素含 量（SPAD)變化。 圖4為轉(zhuǎn)基因植株和野生型對(duì)照的地上部與根部鐵含量比較圖。A，地上部鐵含 量；B，根部鐵含量。【具體實(shí)施方式】 下面通過(guò)具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。 本專(zhuān)利技術(shù)中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。[00幼 實(shí)施例： ，通過(guò)將水稻OsRSI基因?qū)肽康乃荆沟?水稻耐缺鐵性得W增強(qiáng)。 具體步驟如下：[002引 （1)分離和克隆水稻OsRSI基因按照水稻數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站化ttp://;rice.plan憂iology.msu.echVindex.shtml)公布 的水稻全基因序列和OsRSI基因的編碼序列，設(shè)計(jì)引物序列，并在兩條引物的5'端分別添 加酶切位點(diǎn)序列和保護(hù)堿基。引物序列分別為：祀-F:5'-cgggtaccATGCCCGTGACTCAGCACTT 八6-3，（沈9 10側(cè).2);祀-1?:5，-。邑邑邑日扣。1^4〔6(：1'1^6〔61^〇：了661'(：-3，（沈9 10側(cè).3)。取缺 鐵處理（缺鐵處理方法參見(jiàn)ChengLJ等Mut曰tioninnicoti曰namineaminotransferase stimulatedtheFe(II)acquisitionsystemandledtoironaccumulationinrice. PI曰ntPhysiology2007, 145:1647-1657;ZhengLQ等Physiologic曰1 曰ndtr曰nscriptome 曰n曰lysisofiron曰ndphosphorusinteractioninriceseedlings.PI曰ntPhysiology 2009,151:262-274.)十天的水稻幼苗（日本晴，由浙江大學(xué)提供的一個(gè)公開(kāi)使用的水稻品 種）的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄法合成其cDNA，并W此cDNA為模板，在引物對(duì)祀-F和祀-R的引導(dǎo) 下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為熱啟動(dòng)95°C5分鐘；然后95°C30秒，60°C30秒，72°C1 分鐘，30個(gè)循環(huán)后72°C5分鐘。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明PCR產(chǎn)物具有SEQID NO. 1所示的495bp核巧酸序列。 (2)植物表達(dá)載體的構(gòu)建用化ηI和BamHI(市售，肥B公司）酶切回收步驟（1)的PCR產(chǎn)物。通過(guò)化ηI和BamHI雙酶切植物表達(dá)載體PCAMBIA1300 (市售），回收載體骨架。用Τ4DM連接酶連接 上述酶切的PCR產(chǎn)物與載體骨架。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，所構(gòu)建的pCAMBIA1300-35S-0sRSI 載體圖譜如圖1所示。 (3)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得 選取成熟飽滿(mǎn)的日本晴種子脫殼后，經(jīng)消毒濾干后接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇外觀顏色嫩黃、生長(zhǎng)良好的顆粒狀愈傷組織用于遺傳轉(zhuǎn)化。將 pCAMBIA1300-35S-0sRSI載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pCAMBIA13本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種提高水稻苗期耐缺鐵性的方法，其特征在于，通過(guò)將水稻OsRSI基因?qū)肽康乃荆沟盟灸腿辫F性得以增強(qiáng)。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：易可可，王芳，鄧敏娟，徐磊，趙紅玉，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：浙江;33