本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2，所述奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2基因的序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明專利技術(shù)通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2，對(duì)于揭示奶牛瘤胃UTB基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制，探明其瘤胃氮素再循環(huán)機(jī)理，進(jìn)而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)設(shè)及一種奶牛瘤胃尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2。
技術(shù)介紹
近年來，反當(dāng)家畜肉和奶生產(chǎn)中對(duì)環(huán)境的污染問題日益受到關(guān)注。Meta分析表明， 決定奶牛糞污總氮排出的主要因素是飼糧氮攝入量，牛對(duì)飼糧氮的有效利用率只有23%， 瘤胃代謝已被確定為反當(dāng)動(dòng)物氮利用效率低的最重要原因。瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的氨除被微生物用 于合成菌體蛋白外，其余的氨經(jīng)消化道上皮吸收入口靜脈，隨血液進(jìn)入肝臟合成尿素。肝臟 中產(chǎn)生的尿素91 %可通過再循環(huán)重新進(jìn)入消化道內(nèi)，運(yùn)就形成了反當(dāng)動(dòng)物尿素氮的再循環(huán) 利用。運(yùn)種氮的再循環(huán)對(duì)維持反當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)氮的平衡，尤其是在低氮飼糧條件下具有重要 意義。研究表明，低氮飼糧條件下，再循環(huán)至瘤胃的尿素氮顯著增加。探明氮再循環(huán)過程中 尿素轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控機(jī)制有利于采取針對(duì)性措施提高不同飼糧和生理?xiàng)l件下反當(dāng)動(dòng)物的氮利 用。尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子扣Ts)是高選擇性快速通透尿素的膜通道蛋白分子，在牛瘤胃中表達(dá)的 尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子UTB通過參與尿素在瘤胃上皮細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，構(gòu)成了牛瘤胃尿素氮再循 環(huán)過程的重要部分，對(duì)于維持其氮平衡至關(guān)重要。UTB介導(dǎo)的經(jīng)上皮細(xì)胞的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)是經(jīng)刺 激后產(chǎn)生的，且不受已知尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子UTA調(diào)控因子的影響。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于探明奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2。 本專利技術(shù)的技術(shù)方案是：一種奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2,所述奶牛瘤胃 UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2基因的序列如SEQIDN0. 1所示。 陽0化]所述的奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2的構(gòu)建方法，（1)構(gòu)建GATA2轉(zhuǎn)錄因 子蛋白真核表達(dá)載體，將轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)載體分別與Ξ個(gè)缺失片段的UTB基因啟動(dòng)子載 體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，巧光素酶報(bào)告基因分析轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于UTB啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；（2) 根據(jù)牛UTB(AY838799. 1)基因啟動(dòng)子信息，設(shè)計(jì)兩條能夠與GATA2蛋白相結(jié)合的探針并標(biāo) 記，進(jìn)行EMSA，確證GATA2與UTB啟動(dòng)子位點(diǎn)的特異結(jié)合。 轉(zhuǎn)錄因子GATA2應(yīng)用于對(duì)奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。 本專利技術(shù)的有益效果是：通過雙巧光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基 因的轉(zhuǎn)錄因子一一GATA2,對(duì)于掲示奶牛瘤胃UTB基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制，探明其瘤胃氮素再循環(huán)機(jī) 理，進(jìn)而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。【附圖說明】 圖1為UTB基因測(cè)序方向圖； 圖2為部分UTB-1測(cè)序結(jié)果； 圖3為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染載體圖； W11] 圖4為UTB啟動(dòng)子載體圖； 陽01引 圖5為PCDNA3. 1-GATA2載體圖； 圖6為部分PCDNA3. 1-GATA2測(cè)序結(jié)果； 圖7為EMSA試驗(yàn)結(jié)果。【具體實(shí)施方式】 一種奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2,所述奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子 GATA2基因的序列如沈QIDN0. 1所示。 所述的奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2的構(gòu)建方法，（1)構(gòu)建GATA2轉(zhuǎn)錄因 子蛋白真核表達(dá)載體，將轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)載體分別與Ξ個(gè)缺失片段的UTB基因啟動(dòng)子載 體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，巧光素酶報(bào)告基因分析轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于UTB啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；（2) 根據(jù)牛UTB(AY838799. 1)基因啟動(dòng)子信息，設(shè)計(jì)兩條能夠與GATA2蛋白相結(jié)合的探針并標(biāo) 記，進(jìn)行EMSA，確證GATA2與UTB啟動(dòng)子位點(diǎn)的特異結(jié)合。 轉(zhuǎn)錄因子GATA2應(yīng)用于對(duì)奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。 本專利技術(shù)的有益效果是：通過雙巧光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)及EMSA探明奶牛瘤胃UTB基 因的轉(zhuǎn)錄因子一一GATA2,對(duì)于掲示奶牛瘤胃UTB基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制，探明其瘤胃氮素再循環(huán)機(jī) 理，進(jìn)而提高奶牛氮素利用、降低氮素排放。 具體實(shí)驗(yàn)過程如下： 1奶牛瘤胃上皮細(xì)胞UTB核屯、啟動(dòng)子區(qū)域的確定 1.1試驗(yàn)材料 試劑；內(nèi)切酶（F'ermentas);引物Oligo(Invitrogen合成）；TaqDNA化lymer ase(109660；34,Invitrogen) ;T4DNAligase(lU/yL)GiPOOGLF'ermentas);凝膠回收試 劑盒（AP-GX_250,A巧gen) ;GeneRyLerDNALadde;r(SM0332,F'ermentas)等，質(zhì)粒小抽試 劑盒（AP-MN-P-250，Ayxgen)，質(zhì)粒中抽試劑盒（AP-MD-P-25，Ayxgen)，質(zhì)粒大抽試劑盒 (ΑΡ-ΜΧ-Ρ-25,Ayxgen)； 293 細(xì)胞（華大）；DMEM培養(yǎng)基 +10 %FBS(Invitrogen);轉(zhuǎn)染試劑： lipofectamine2000(Invit;rogen);雙巧光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega)。儀器：臺(tái)式冷凍離屯、機(jī)（Neofugel3R,HealF'orce)，生物安全柜 化FSafe-1800,Heal化rce)，PCR儀燈 100TM,Bio-Rad)，電泳成像系統(tǒng)燈anonieOO,天能）， 干式恒溫儀（TU-100C，一恒科技）溫控?fù)u床燈監(jiān)-98,太倉(cāng)）等；Mudulus測(cè)定儀（Tu;rne;rBiosystems) ;6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning) ;C02 培養(yǎng)箱 (Thermo);巧光顯微鏡（Olympus)。 陽0%] 1. 2試驗(yàn)方法 1.2. 1啟動(dòng)子載體構(gòu)建 啟動(dòng)子載體構(gòu)建采用PCR法，具體方法如下： 陽〇29] 設(shè)計(jì)引物 根據(jù)根據(jù)Genbank中公布的UTB序列（AY838799. 1)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)奶牛 UTB啟動(dòng)子的核酸片段進(jìn)行了生物學(xué)信息分析，每個(gè)祀基因序列設(shè)計(jì)并合成2條PCR擴(kuò)增引 物（帶酶切位點(diǎn)）。 1.2.2目的基因片段準(zhǔn)備 (l)DNA提取：采集成年荷斯坦奶牛瘤胃上皮組織，提取基因組DM并定量。 陽03引 似PCR反應(yīng)：按照W下表格配制PCR反應(yīng)體系。 擴(kuò)增條件：按照W下條件在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)； (3)凝回收：PCR產(chǎn)物割取目的條帶后經(jīng)Axygen凝膠回收試劑盒純化（按照產(chǎn)品 說明書操作）； (4)定量：純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行0D質(zhì)檢并定量； 巧)PCR產(chǎn)物酶切及回收純化：按如下體系37°C水浴化，酶切后割膠回收純化（按 照Axygen凝膠回收試劑盒說明書操作）。 (6)純化后酶切片段進(jìn)行OD質(zhì)檢并定量。 1. 2. 3骨架載體構(gòu)建 (1)骨架載體酶切反應(yīng)和回收純化：按照下述體系37°C水浴化，酶切后膠回收 (按照Axygen膠回收試劑盒說明書操作） (2)純化后酶切片段進(jìn)行0D質(zhì)檢并定量。 1. 2. 4連接轉(zhuǎn)化與測(cè)序驗(yàn)證 連接反應(yīng)：按W下體系于恒溫儀上進(jìn)行連接，連接條件：16°C，過夜。 陽化0] 1.2. 5轉(zhuǎn)化、菌檢和測(cè)序 (1)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，涂板過夜培養(yǎng)， (2)從平板上隨機(jī)挑選完全落單的菌落，用菌檢PCR方法檢測(cè)， (3)挑取陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證。 1. 2. 6質(zhì)粒抽提和檢驗(yàn) 陽056] 測(cè)序正確的菌液放大培養(yǎng)，利用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒和方法抽提質(zhì)粒，抽提的 質(zhì)粒進(jìn)行0D測(cè)定。 1.2. 7啟動(dòng)子載體檢測(cè) 啟動(dòng)子載體活性檢測(cè)采用巧光素酶報(bào)告基因進(jìn)行。 (1)細(xì)胞培養(yǎng)：于二氧化碳培養(yǎng)箱中用DMEM+10 %胎牛血清 (化ta化ovineserum，F(xiàn)B巧培養(yǎng)基按常規(guī)培養(yǎng)293細(xì)胞，本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2，其特征在于：所述奶牛瘤胃UTB基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA2基因的序列如SEQIDNO.1所示。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：廉紅霞，孫宇，李改英，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：河南;41
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