本發明專利技術提供一種檢測血液中微生物的方法，該方法包括下列步驟：(1)將2,3,5‐三苯基氯化四氮唑(TTC)直接加入血培養瓶；或2,3,5‐三苯基氯化四氮唑混合到硅橡膠富氧膜中，制備成固體指示劑，并固定在血培養瓶底部；所述TTC濃度為0.01‐0.03g/mL；(2)向血培養瓶中加入血培養基，并于121℃，滅菌20min；(3)向血培養瓶中加入血液樣品，在35℃條件下培養0‐5天后；(4)檢測血培養瓶中指示帶的光反射強度，繪制光反射強度曲線，根據光反射強度曲線確定微生物生長結果。本發明專利技術在臨床應用上具有成本低、操作流程簡單、檢測時間短、陽性檢出率高等優點，有較大的應用價值。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物技術，具體微生檢測方法，尤其涉及一種。
技術介紹
血培養是臨床實驗室重要的檢測項目之一，由于菌血癥、敗血癥的死亡率高達30-50%，因此，準確及時的培養結果對臨床檢測和治療有重要意義。目前中國內血培養中細菌的陽性檢出率僅為10%，其可能原因為:1、血液中的含菌量低；2、血液中的抗菌物質；3、抗生素的應用；4、培養條件的限制。目前市場上的血培養檢測產品主要以0)2檢測法為主，主要的測定技術有放射性標記技術、熒光檢測技術和分光光度技術。因細菌在其生長代謝過程中會產生C02，這些技術的原理都是通過檢測血液樣品在培養過程中中是否有0)2的產生來判定血液中是否有微生物。但這種基于細菌產生C02的檢測方法，會因為一些不能利用糖代謝的微生物(如非發酵菌)，其代謝過程不產生C02或產生的C02量極低，從而導致測定結果呈陰性。2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)作為一種特殊的氧化還原指示劑，可以捕捉細胞或細菌呼吸過程中產生的電子，從無色的氧化型變成紫色的還原型，從而可以檢測出血液中不產生C02的微生物。用TTC作指示劑有陽性檢出率高，檢出時間短的優點，對于提高血培養技術有重要幫助。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題在于研究設計采用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)作為一種特殊的氧化還原指示劑來檢測血液中是否含有微生物，達到提高血培養技術的效果。本專利技術提供一種，該方法包括下列步驟:(1)將2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)與血培養基加入血培養瓶，再加入35-40mL血培養基及2_4g樹脂粒，所述2，3，5-三苯基氯化四氮唑在血培養基及樹脂粒混合物中濃度為0.01-0.03g/mL ;或2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡膠富氧膜中，制備成固體指示劑，并固定在血培養瓶底部，再加入35-40mL血培養基及2_4g樹脂粒；所述2，3，5-三苯基氯化四氮唑在硅橡膠富氧膜中濃度為0.01-0.03g/mL ；(2)血培養瓶于121°C，滅菌20min ；(3)向血培養瓶中加入血液樣品，在34_36°C條件下培養0_5天；(4)檢測血培養瓶中指示帶的光反射強度，繪制光反射強度曲線，根據光反射強度曲線確定微生物生長結果。本專利技術方法所述步驟(1)硅橡膠富氧膜為:25mL的聚二甲基硅氧烷、750yL正桂酸乙酯、100 μ L 二月桂酸二丁基錫和1.25mL環己烷混合物。所述步驟(l)TTC先用等質量的單蒸水溶解再應用。所述步驟⑴血培養基35_40mL混合2_4g樹脂粒；所述血培養基選自肉湯培養基、大豆酪蛋白培養基或胰酪胨大豆肉湯培養基,優選為35mL肉湯培養基；所述樹脂粒為0.2-0.8mm粒徑的陽離子交換樹脂粒或非離子吸附樹脂粒，所述陽離子交換樹脂粒選自732陽離子交換樹脂粒、強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂、超強性苯乙烯系陽離子交換樹脂、大孔強堿性季銨型陽離子交換樹脂；非離子吸附樹脂粒選自聚苯乙烯型吸附樹脂或Amberlite XAD-4非離子型大孔樹脂。所述步驟(4)590nm/750nm雙波長的光波為用于檢測將2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)與血培養基及樹脂粒加入血培養瓶中的培養樣品；570-610nm光波波長用于檢測將2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡膠富氧膜制備成固體指示劑，并固定在血培養瓶底部，再加入血培養基及樹脂粒的培養樣品。步驟(4)所述的指示帶為:將2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)直接加入培養基的血培養瓶方法是指距離培養基表層2-3cm處的培養基；將2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)混合到硅橡膠富氧膜的血培養瓶是指培養瓶底部的硅橡膠富氧膜。用本專利技術對105例臨床樣本進行的血培養實驗結果表明，本專利技術的陽性檢出率為20%。現有技術為檢出率為5%。本專利技術的有益效果:(1)本專利技術創新的使用了 TTC作為檢測微生物的指示劑，其特點為TTC可以捕捉微量的微生物釋放的電子被還原形，從而顯示出顏色濃郁的紫色，使實驗結果容易觀察。(2)本專利技術利用還原型TTC在波長為590nm處有強吸收峰的特點，選用570_610nm波長的光波作為檢測波長，可以精確的判斷血液中是否含有微生物。(3)本專利技術在臨床應用上具有成本低、操作流程簡單、檢測時間短、陽性檢出率高等優點，有較大的應用價值。【附圖說明】圖1為實施例1的血培養檢測結果，圖中縱坐標為光放射強度轉變的電信號，單位:mv。橫坐標為時間,單位:min。圖中縱坐標值1.1處直線為閾值。滿足:(1)檢測信號值大于閾值；⑵檢測曲線出現“S”形曲線兩個條件，即為陽性信號。圖1說明檢測結果為陽性，血培養瓶中有細菌生長，陽性檢出時間為13小時左右。圖2為實施例2的血培養檢測結果，圖中縱坐標為光放射強度轉變的電信號，單位:mv。橫坐標為時間，單位:min。圖中縱坐標值1.2處直線為閾值。滿足:⑴檢測信號值大于閾值；⑵檢測曲線出現“S”形曲線兩個條件，即為陽性信號。圖2說明檢測結果為陽性，血培養瓶中有細菌生長，陽性檢出時間為13小時左右。圖3為實施例2的血培養檢測結果，圖中縱坐標為光放射強度轉變的電信號，單位:mv。橫坐標為時間,單位:min。圖中縱坐標值1.2處直線為閾值。滿足:(1)檢測信號值大于閾值；⑵檢測曲線出現“S”形曲線兩個條件，即為陽性信號。圖3說明檢測結果為陽性，血培養瓶中有細菌生長，陽性檢出時間為62小時左右。【具體實施方式】實施例1 (本專利技術使用了 TTC作為檢測微生物的指示劑方法)(1)取25mL的聚二甲基硅氧烷、750 μ L正桂酸乙酯、100 μ L 二月桂酸二丁基錫、1.25mL環己烷和0.5g的TTC(TTC先用0.5g單蒸水溶解)于容器中混合均勻，并加入到血培養瓶底部，在35°C凝固，制備成硅橡膠富氧膜；(2)向血培養瓶中加入40mL肉湯培養基和4g732陽離子交換樹脂粒(國藥集團生產)，并于121。。，滅菌20min ；(3)于上海市華東醫院住院部采集有發熱(彡38°C )或低溫(彡36°C )，寒戰，白細胞增多體征的患者的血液標本用于實驗。向血培養瓶中加入10mL血液樣品；(4)將加入血當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
檢測血液中微生物的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟：(1)將2,3,5?三苯基氯化四氮唑TTC與血培養基加入血培養瓶，再加入35?40mL血培養基及2?4g樹脂粒，所述2,3,5?三苯基氯化四氮唑在血培養基及樹脂粒混合物中濃度為0.01?0.03g/mL；或2,3,5?三苯基氯化四氮唑TTC混合到硅橡膠富氧膜中，制備成固體指示劑，并固定在血培養瓶底部，再加入35?40mL血培養基及2?4g樹脂粒；所述2,3,5?三苯基氯化四氮唑在硅橡膠富氧膜中濃度為0.01?0.03g/mL；(2)血培養瓶于121℃，滅菌20min；(3)向血培養瓶中加入血液樣品，在34?36℃條件下培養0?5天；(4)檢測血培養瓶中指示帶的光反射強度，繪制光反射強度曲線，根據光反射強度曲線確定微生物生長結果。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王龍，胡維，冉葦，
申請(專利權)人：上海復星長征醫學科學有限公司，上海星佰生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：上海;31
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