本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種定點(diǎn)突變改造的酵母二肽基肽酶III。本發(fā)明專利技術(shù)所述的定點(diǎn)突變改造的酵母二肽基肽酶III，其特征在于：它是由氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1的來(lái)源于Saccharomyces?cerevisiae?S288c的酵母二肽基肽酶III中制造多個(gè)氨基酸取代而產(chǎn)生的突變體，所述的氨基酸取代包括第570、572、574位的取代，以致所述定點(diǎn)突變改造的酵母二肽基肽酶III為對(duì)6-甲氧基雙呋喃香豆素具有氧化分解作用的酶。本發(fā)明專利技術(shù)所述的定點(diǎn)突變改造的酵母二肽基肽酶III可應(yīng)用于制備飼料及其添加劑或食品及其添加劑中消除6-甲氧基雙呋喃香豆素的產(chǎn)品，還可應(yīng)用于制備預(yù)防由6-甲氧基雙呋喃香豆素誘發(fā)的疾病的藥物。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)設(shè)及一種二膚基膚酶III，特別設(shè)及一種定點(diǎn)突變改造的酵母來(lái)源的二膚 基膚酶ΙΠ。
技術(shù)介紹
二膚酶III(DPPsIII，EC3.4. 14. 4)，如來(lái)自酵母的二膚酶III、來(lái)自人類的二膚 酶III、來(lái)自大鼠的二膚酶III、來(lái)自兔的二膚酶III等，是一組分子內(nèi)含有特殊的肥XXGH 鋒指結(jié)構(gòu)的金屬蛋白酶，具有水解多膚鏈的氨基末端切掉二膚的膚酶。DPPIII在生理功能 上與腦啡膚和血管緊張素II、血管緊張素III、促黑色素等重要的生理活性膚的新陳代謝 有關(guān)。DPPs存在于各種哺乳動(dòng)物的組織中，根據(jù)亞細(xì)胞的定位、特異性地?zé)o核抑制劑的敏 感性，二膚基膚酶分成不同的類型DPPI~DPPIV。DPPIII可W選擇性地從多膚鏈或蛋 白質(zhì)的N-末端水解掉二膚殘基，如：Arg-Arg-，Ala-Arg-，或者Tyr-Gry。酵母來(lái)源的DPP III由712個(gè)氨基酸組成，鋒離子是其催化金屬離子。其氨基酸序列與黃曲霉毒素單加氧酶 (Aflatoxinmonooxygenas，AFMO)的同源性達(dá)到37%，但不具有對(duì)6-甲氧基雙巧喃香豆素 氧化分解的功能。 黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的劇毒性次生代謝產(chǎn)物，已經(jīng) 確定的黃曲霉毒素分子的結(jié)構(gòu)主要有八種，其中毒性最強(qiáng)的黃曲霉毒素B1 (也稱6-甲氧 基雙巧喃香豆素）被認(rèn)為是潛在的對(duì)人類危害極為突出的一類強(qiáng)致癌誘變劑，一次大量攝 入會(huì)引起人及動(dòng)物的急性中毒、甚至死亡；小劑量長(zhǎng)期攝入會(huì)致崎、致突變和致癌，即使幾 十ppb的含量仍有極大的毒性；I族黃曲霉毒素含有巧喃雙鍵結(jié)構(gòu)。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的對(duì) 6-甲氧基雙巧喃香豆素具有分解作用的生物酶極少。黃曲霉毒素單加氧酶（AFM0)是一個(gè) 對(duì)6-甲氧基雙巧喃香豆素有氧化分解作用的酶。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素單加氧酶氧化分 解6-甲氧基雙巧喃香豆素的過(guò)程為：從底物分子中獲得電子傳遞給氧，使水還原成過(guò)氧化 氨，將底物氧化并進(jìn)一步使分子中的巧喃雙鍵開環(huán)。在運(yùn)個(gè)過(guò)程中，由分子內(nèi)的變價(jià)離子的 價(jià)態(tài)變化來(lái)實(shí)現(xiàn)電子的傳遞，首先，結(jié)合在AFM0上的二價(jià)金屬離子奪得底物的一個(gè)電子， 自身變成一價(jià)離子，然后不穩(wěn)定的一價(jià)離子將奪得的運(yùn)個(gè)電子傳遞給氧，自身又轉(zhuǎn)變成穩(wěn) 定的二價(jià)離子，氧氣分子獲得一個(gè)電子在水分子的參與下生成過(guò)氧化氨，同時(shí)底物轉(zhuǎn)變?yōu)?它的環(huán)氧化物。然后，該環(huán)氧化物伴隨著過(guò)氧化氨的作用發(fā)生氧化水解反應(yīng)，最終使底物分 子中的巧喃雙鍵斷開。黃曲霉毒素單加氧酶是目前已報(bào)道的用于黃曲霉毒素解毒的生物 酶。因此，發(fā)現(xiàn)和制造新的對(duì)6-甲氧基雙巧喃香豆素具有氧化分解作用的酶，對(duì)發(fā)展黃曲 霉毒素消減技術(shù)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的首要目的是提供一種定點(diǎn)突變的酵母二膚基膚酶III，該酵母二膚基膚 酶III突變體對(duì)6-甲氧基雙巧喃香豆素具有氧化分解功能。 陽(yáng)0化]本專利技術(shù)所述的一種定點(diǎn)突變改造的酵母二膚基膚酶ΙΠ是由氨基酸序列為SEQID NO. 1的來(lái)源于酵母SaccharomycescerevisiaeS288c的酵母二膚基膚酶III(NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) 登錄號(hào)為NM_001183312)中制造多個(gè)氨基酸取代而產(chǎn)生的、對(duì)6-甲氧基雙巧喃香豆素有氧 化分解作用的酵母二膚基膚酶III突變體，所述的氨基酸取代包括第570、572和574位的 取代。 根據(jù)本專利技術(shù)所述的定點(diǎn)突變改造的酵母二膚基膚酶III的進(jìn)一步特征，所述第 570位的氨基酸用丙氨酸（Alanine，ALa，A)取代賴氨酸（Lysine，Lys，K);第572位的氨基 酸取代是用賴氨酸化ysine，Lys，K)取代甘氨酸（Glycine，Gly，G);第574位的氨基酸取代 是用組氨酸化istidine,化s，H)取代色氨酸（T巧ptophan，T巧，W);所述的定點(diǎn)突變改造的 酵母二膚基膚酶III突變體的氨基酸序列為SEQIDNO. 2。 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本專利技術(shù)所述的定點(diǎn)突變改造的酵母二膚基膚酶III(W下縮寫為 "myDPP")具有對(duì)于6-甲氧基雙巧喃香豆素的氧化分解功能。該突變體酶在抑6.0、反應(yīng) 溫度25°C處理6-甲氧基雙巧喃香豆素（lOOppb) 50分鐘后，其對(duì)6-甲氧基雙巧喃香豆素的 氧化分解效率達(dá)到90%。該突變體酶的其它酶學(xué)性質(zhì)與野生酶相似。 進(jìn)一步地，本專利技術(shù)提供了一種DNA分子，其編碼本專利技術(shù)所述的定點(diǎn)突變改造的酵 母二膚基膚酶III。 優(yōu)選地，本專利技術(shù)所述的DNA分子的核巧酸序列為SEQIDNO. 3。 本專利技術(shù)的另一個(gè)目的是提供一種載體，其含有本專利技術(shù)所述的DM分子。 本專利技術(shù)的又一個(gè)目的是提供一種宿主細(xì)胞，其含有本專利技術(shù)所述的DNA分子，或者 含有本專利技術(shù)所述的載體。 上述載體和宿主細(xì)胞都可W通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)手段進(jìn)行制備。 本專利技術(shù)還提供了本專利技術(shù)所述的定點(diǎn)突變改造的酵母二膚基膚酶III的生產(chǎn)方法， 包括：在適于二膚基膚酶III表達(dá)的條件下培養(yǎng)本專利技術(shù)所述的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中分 離所述的酵母二膚基膚酶III。 當(dāng)本專利技術(shù)所述的DNA分子W合適的取向和正確的閱讀框插入到所述的載體或者 轉(zhuǎn)入所述的宿主細(xì)胞中，所述的DNA分子可W在任何真核或者原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。許多 宿主-載體系統(tǒng)都可W用來(lái)表達(dá)蛋白質(zhì)編碼序列。宿主-載體系統(tǒng)包括但不限于：用隧菌 體、質(zhì)粒或粘粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；含有酵母載體的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞 系統(tǒng)；用病毒感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用細(xì)菌感染的植物細(xì)胞系統(tǒng)。本專利技術(shù)優(yōu)選的載體包括 病毒載體、質(zhì)粒、粘粒或者寡核巧酸。 本專利技術(shù)優(yōu)選的宿主為真核系統(tǒng)如畢赤酵母；本專利技術(shù)優(yōu)選的蛋白質(zhì)表達(dá)方法為畢赤 酵母甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)。 本專利技術(shù)人成功地獲得了一種定點(diǎn)突變改造的酵母二膚基膚酶III，通過(guò)活性鑒定 實(shí)驗(yàn)，證明該二膚基膚酶III突變體具有野生型二膚基膚酶ΠΙ所不具備的氧化分解6-甲 氧基雙巧喃香豆素的生物活性，且該生物活性達(dá)到了應(yīng)用于飼料及其添加劑加工、食品及 其添加劑加工W及藥物開發(fā)的程度。 本專利技術(shù)的另一目的是提供將所述的定點(diǎn)突變改造的酵母二膚基膚酶III在制備 飼料及其添加劑或食品及其添加劑中消除6-甲氧基雙巧喃香豆素的產(chǎn)品的應(yīng)用。結(jié)合目 前的飼料和食品的加工工藝，可將本專利技術(shù)所述的定點(diǎn)突變改造的酵母二膚基膚酶III作為 脫毒劑添加到飼料中進(jìn)行飼料脫毒，或者制成固定化酶用于如花生油等食品的脫毒，或制 成能夠表達(dá)該酶的益生菌制劑或益生菌微囊等用于食品、糧油、飼料等的脫毒。 本專利技術(shù)的另一目的是提供將所述的定點(diǎn)突變改造的酵母二膚基膚酶III在制備 預(yù)防由6-甲氧基雙巧喃香豆素誘發(fā)的疾病的藥物的應(yīng)用。結(jié)合目前的常規(guī)藥物制備工藝， 可用本專利技術(shù)所述的定點(diǎn)突變改造的酵母二膚基膚酶III制得到用于預(yù)防由6-甲氧基雙巧 喃香豆素誘發(fā)的疾病（例如腫瘤）的藥物。【附圖說(shuō)明】 圖1為重組質(zhì)粒myDPP表達(dá)質(zhì)粒的鑒定圖。 圖2為重組myDPP和重組wtyDPP的純化結(jié)果。【具體實(shí)施方式】 本文中所采用的術(shù)語(yǔ)，除非另有說(shuō)明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。W 下提供在本專利技術(shù)中使用的一些特殊術(shù)語(yǔ)的定義。 "wtyDPP"表示野生型酵母二膚基膚酶III，其基因W斜體wtyDPP表示。 陽(yáng)02引 "myDPP"表示突變體酵母二膚基膚酶III，其基因W斜體myDPP表示。實(shí)施本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種定點(diǎn)突變改造的酵母二肽基肽酶III，其特征在于：它是由氨基酸序列為SEQ?ID?NO.1的來(lái)源于Saccharomyces?cerevisiae?S288c的酵母二肽基肽酶III中制造多個(gè)氨基酸取代而產(chǎn)生的突變體，所述的氨基酸取代包括第570、572、574位的取代，以致所述定點(diǎn)突變改造的酵母二肽基肽酶III為對(duì)6?甲氧基雙呋喃香豆素具有氧化分解作用的酶。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉大嶺，姚冬生，吳曦陽(yáng)，謝春芳，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：暨南大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44
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