本發明專利技術公開了一種尿液中exosome源性miRNAs生物標記物的檢測方法，屬于分離、制備或純化DNA或RNA的方法領域。本發明專利技術從人尿液中提取exosome小體，通過電鏡與Western?blot對其進行形態學及蛋白鑒定，通過NanoSight?LM10對其進行大小分布分析；鑒定分析后從中提取包含miRNAs的total?RNA，冷凍干燥法對total?RNA進行純化分析，然后進行反轉錄及熒光定量PCR擴增，分離鑒定出所需的miRNAs生物標記物。本發明專利技術以尿液為實驗材料，不僅收集簡便、無創、數量大，而且其內含有大量的exosome，為鑒定miRNAs生物標記物提供了物質基礎，具有廣闊的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分離、制備或純化DNA或RNA的方法領域，具體是一種尿液中exosome的miRNAs生物標記物的檢測方法。
技術介紹
exosome是細胞內多囊泡體(multivesicular bodies, MVBs)的腔內囊泡，被大量釋放于生物體液中，例如血液、尿液、腦脊液、惡性胸腹水、羊水及滑液等體液。在MVBs與細胞膜融合之后以胞吐的方式釋放入細胞外環境中，直徑為30?150 nm。exosome含有多種蛋白質、mRNAs及miRNAs，exosome能夠攜帶RNA分子循環于血液中進行長距離的細胞間通訊。目前，以無創性方法收集的常見生物體液是血清與血漿，其中循環miRNAs近年來備受關注。與mRNAs相比較，循環miRNAs比較穩定，能耐受儲存與凍融循環，減少物理降解，同時也能抵抗血清中核糖核酸酶(RNAse)及體外RNAse A等生物化學降解。在富于RNAse的血液環境中，許多機制保護循環miRNAs，其中exosome被認為是一種主要的保護機制。exosome的外膜對RNA提供了全面的保護，將其與易于消化的細胞外環境隔絕。以無創性方法收集的另一種常見生物體液是尿液，尿液不僅容易獲得，而且收集簡便、無創、數量大。存在于尿液中的miRNAs與循環miRNAs的保護機制大致相同，但由于尿液成分復雜，而且泌尿系統中存在大量的RNAse活性，使得尿液中的裸miRNAs更易于降解，因此研究源于exosome的miRNAs更具有現實意義。
技術實現思路
本專利技術就是為了提供一種來源于尿液的exosome的制備方法以及從中提取和鑒定其所包含的miRNAs生物標記物的方法，所提出的一種。本專利技術是按照以下技術方案實現的。—種尿液中exosome的miRNAs生物標記物的檢測方法，包括以下步驟: a.exosome的制備 收集尿液，按照體積比為尿液:蛋白酶抑制劑混合物=50:4.22的比例加入蛋白酶抑制劑混合物；1-4° C，1800-2200g條件下離心去除細胞沉淀及膜碎片；取上清，1-4° C，15000-17000g條件下離心去除大直徑多囊泡體；取上清，1-4° C，150000-200000g條件下離心收集沉淀；用無RNAse水重懸沉淀，再次在1-4° C，150000-200000g條件下離心收集沉淀，即得exosome ； b.total RNA提取及純化 按照體積比為尿液量:TRIzol LS溶液=100:1的比例，向步驟a獲得的沉淀中加入TRIZ0L LS溶液，混勻；并按照體積比為TRIZOL LS溶液:氯仿=5:1的比例，加入氯仿，離心；吸取上層水相并加入異丙醇，靜置過夜，離心；用75%乙醇洗滌沉淀后，離心收集沉淀，干燥，用無RNAse水重懸RNA沉淀；真空冷凍干燥儀純化上述溶解后total RNA ; c.合成miRNAcDNA第一鏈 ①miRNA3’末端加Poly(A)反應； ②Poly(A)修飾的miRNA逆轉錄反應； d.熒光定量qPCR反應 將步驟 c ②中獲得的 miRNA 第一鏈 cDNA 進行 hsa-miR-15b_3P，hsa-miR-15a_3P 及hsa-miR-135b-5P的熒光定量檢測。本專利技術獲得了如下的有益效果:本專利技術提供了一種來源于尿液的exosome的制備方法以及鑒定其中所包含的miRNAs生物標記物的方法。與從血清與血楽中提取exosome并進一步富集miRNAs的方法相比，本專利技術所使用的生物體液更容易獲得，收集簡便、無創、數量大。不僅如此，尿液中存在著大量的exosome，而且exosome的外膜對其中的miRNAs具有很好的保護作用。本專利技術獲得了來源于尿液的exosome及其中miRNAs的種類，具有廣闊的應用前景。【附圖說明】圖1是本專利技術透射電鏡下exosome形態及大小圖； 圖2是本專利技術NanoSight LM10檢測exosome大小分析圖； 圖3是本專利技術Western Blot檢測exosome標記蛋白TSG101和CD9的鑒定圖； 圖 4 是本專利技術 RT-qPCR 進行 hsa-miR-15b_3P，hsa-miR-15a_3P 及 hsa-miR-135b_5P 檢測后平均CT值分析圖。【具體實施方式】下面結合附圖及實施例對本專利技術做進一步詳細的說明。1.exosome的制備:留取清晨中段尿液200ml，每50ml尿液加入蛋白酶抑制劑混合物(包括 1.67ml 的 lOOmM NaN3, 2.5ml 的 10mM PMSF，50ul 的 ImM Leup印tin);4° C，2000g離心10分鐘，去除細胞沉淀及膜碎片；取上清4° C，17000g離心45分鐘，去除大直徑多囊泡體；取上清 4。C，200000g (BECKMAN COULTER、L-100 XP Ultracentrifuge)離心 65分鐘；去除上清，無RNAse水重懸沉淀；4° C，200000g再次離心65分鐘，所得沉淀即為exosome ； 每50ml尿液所得沉淀根據進一步實驗目的，用相同體積的不同溶液溶解，用于電鏡觀察的用30ul無水乙醇溶解，用于Western Blot及NanoSight LM10檢測的用30ul PBS溶液溶解，exosome溶解液于_80°C保存備用。2.Exosome的電鏡觀察及NanoSight LM10分析:用無水乙醇溶解exosome沉淀，超聲波分散exosome懸浮液5分鐘，將少許懸浮液滴于超薄碳膜銅網上，充分瞭干，1%。磷鶴酸負染，充分瞭干，透射電鏡觀察、拍照。如圖1所不，exosomes的負染電鏡照片顯不尿液來源的exosomes小體為扁平或球形小體，直徑約為50nm左右(圖1中箭頭處所示)；如圖2所示，NanoSight LM10分析顯示本專利技術尿液中的exosome大小在30nm?500nm范圍之內，但是主要集中于140nm處。3.Exosome 的 Western Blot 檢測:用 30ul PBS 溶解 exosome 沉淀，BCA 法測定exosome蛋白濃度；計算蛋白濃度，加入非還原性5X SDS上樣緩沖液，95° C變性5分鐘；配制5%濃縮膠與12%分離膠；將變性后混合物上樣，電泳(濃縮膠時電壓為80V，分離膠時電壓為150V左右)；應用0.22um PVDF膜進行電轉，100V 1小時；5%牛奶封閉10分鐘；一抗⑶9稀釋1500倍，TSG101稀釋2000倍，室溫孵育90分鐘；通用二抗(辣根酶標記山羊抗兔或鼠IgG)稀釋5000倍，室溫孵育45分鐘；顯影，拍照(顯影液即用即配)。如圖3所示，Western Blot檢測同一例樣本exosome中標記蛋白TSG101和0)9均表達，且TSG101表達尚于⑶9的表達。4.包含miRNAs的total RNA的提取及純化:100ml尿液超速離心所得exosome沉淀加入1ml TRIzol L當前第1頁1 2 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種尿液中exosome源性miRNAs生物標記物的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：a.?exosome的制備收集尿液，按照體積比為尿液:蛋白酶抑制劑混合物=50:4.22的比例加入蛋白酶抑制劑混合物；1800?2200g條件下離心去除細胞沉淀及膜碎片；取上清，15000?17000g條件下離心去除大直徑多囊泡體；取上清，?150000?200000g條件下離心收集沉淀；用無RNAse水重懸沉淀，再次在150000?200000g條件下離心收集沉淀，即得exosome；以上離心操作均在1?4°C條件下進行；b.total?RNA提取及純化按照體積比為尿液量:?TRIzol?LS溶液=100:1的比例，向步驟a獲得的沉淀中加入TRIZOL?LS溶液，混勻；并按照體積比為TRIZOL?LS溶液:?氯仿=5:1的比例，加入氯仿，離心；吸取上層水相并加入異丙醇，靜置過夜，離心；用75%乙醇洗滌沉淀后，離心收集沉淀，干燥，用無RNAse水重懸RNA沉淀；真空冷凍干燥儀純化上述溶解后total?RNA；c.合成miRNA?cDNA第一鏈①miRNA?3'末端加Poly(A)反應；②Poly(A)修飾的miRNA逆轉錄反應；d．熒光定量qPCR反應將步驟c②中獲得的miRNA第一鏈cDNA進行hsa?miR?15b?3P，hsa?miR?15a?3P及hsa?miR?135b?5P?的熒光定量檢測。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王愛香，徐勇，暢繼武，劉昆，劉春雨，馮士樓，趙津輝，李玉皓，
申請(專利權)人：天津市泌尿外科研究所，
類型：發明
國別省市：天津;12
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