本發(fā)明專利技術(shù)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種高效表達重組八因子的灌注培養(yǎng)方法。本發(fā)明專利技術(shù)提供一種高效表達重組八因子的灌注培養(yǎng)方法，包括如下步驟：1）將重組FVIII細胞株的種子接種于反應(yīng)器中進行批培養(yǎng)；2）當培養(yǎng)體系中葡萄糖含量為0.5?1.5g/L時，使用旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法進入灌注培養(yǎng)模式；3）當反應(yīng)器內(nèi)的細胞處于一個穩(wěn)態(tài)階段，使用聲頻灌流方法和旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法同時進行灌注培養(yǎng)，維持細胞密度在2?3*10
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物
，特別是涉及一種高效表達重組八因子的灌注培養(yǎng)方 法。
技術(shù)介紹
凝血八因子是目前治療血友病A (Hemophilia A, HA)的唯一治療方法，HA患者因 基因缺陷導(dǎo)致FVIII表達降低或功能缺陷，表現(xiàn)為凝血功能障礙和自發(fā)性出血。目前市售 有人血FVIII以及基因重組FVIII。但是人血FVIII產(chǎn)品仍然存在傳播不明血源性病原體 的可能，因此，在重組DNA技術(shù)的日益發(fā)展進步下，重組FVIII產(chǎn)品越來越受到重視。 重組FVIII是利用基因重組技術(shù)，將編碼FVIII蛋白的基因片段插入質(zhì)粒載體中， 而后將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)入能夠表達FVIII蛋白的哺乳動物細胞內(nèi)。由于FVIII蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因 此必須選擇哺乳動物宿主細胞作為FVIII的表達載體。與細菌或酵母細胞不同，哺乳動物 細胞具有翻譯后修飾功能，例如溶蛋白性裂解、糖基化作用、羥基化作用及硫酸鹽化作用， 這些功能是形成具有活性的FVIII蛋白二、三級結(jié)構(gòu)所必須的。但是由于FVIII是個特殊 的蛋白，糖基化比較復(fù)雜，蛋白不穩(wěn)定，在培養(yǎng)過程中受溫度等培養(yǎng)條件影響很大，為了在 發(fā)酵過程中保證rFVIII的濃度以及質(zhì)量，需要采用灌注培養(yǎng)的方式。 灌注培養(yǎng)是指把細胞和培養(yǎng)基一起加入生物反應(yīng)器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成的 過程中，不斷地將部分培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌入新的培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)方式。連 續(xù)的灌注培養(yǎng)可以提供給細胞充分的營養(yǎng)成分，同時帶走代謝副產(chǎn)物，給細胞的生長提供 優(yōu)良的環(huán)境，維持較高的細胞密度，使得細胞表達時間延長，可以大幅度提高生產(chǎn)產(chǎn)率。 實現(xiàn)細胞灌注培養(yǎng)的核心技術(shù)是如果有效地對細胞進行截留，即在保證細胞密度 和活力的基礎(chǔ)上更換培養(yǎng)基。目前，常用的利用細胞截留裝置達到細胞灌注培養(yǎng)的方法主 要有：傾斜式重力沉降設(shè)備、離心細胞分離裝置、旋轉(zhuǎn)過濾灌注設(shè)備（Spin filter)、聲頻灌 流裝置、中空纖維柱細胞截留裝置等。雖然能夠適用的方法種類較多，但是這些方法均有非 常明顯的缺陷。
技術(shù)實現(xiàn)思路
如上所述，現(xiàn)有技術(shù)中的各種方法均有非常明顯的缺陷。所以鑒于以上所述現(xiàn)有 技術(shù)的缺點，本專利技術(shù)的目的在于提供，用于解決 現(xiàn)有技術(shù)中的問題。本專利技術(shù)所提供的高效表達重組八因子的灌注培養(yǎng)方法能夠同時充分發(fā) 揮截留方法和重組FVIII的灌注培養(yǎng)生產(chǎn)工藝的優(yōu)勢，達到提高并維持細胞生長密度、延 長生產(chǎn)周期、增加 FVIII的產(chǎn)量、并保證FVIII的質(zhì)量的效果。 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本專利技術(shù)第一方面提供一種高效表達重組八因子 的灌注培養(yǎng)方法，包括如下步驟： 1)將重組FVIII細胞株的種子接種于反應(yīng)器中進行批培養(yǎng)； 2)當培養(yǎng)體系中葡萄糖含量為0. 5-1. 5g/L時，使用旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法進入灌注 培養(yǎng)模式； 3)當反應(yīng)器內(nèi)的細胞處于一個穩(wěn)態(tài)階段，使用聲頻灌流方法和旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法 同時進行灌注培養(yǎng)，維持細胞密度在2-3*10 7個/ml。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)重組FVIII細胞株的種類和具體實驗需求，選取合適的條 件對重組FVIII細胞株的種子進行擴增，并進一步將擴增所得的產(chǎn)物用于步驟1的接種過 程中。 所述旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法具體指：將一個旋轉(zhuǎn)過濾器（旋轉(zhuǎn)過濾灌注設(shè)備、Spin filter)按放在反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)軸上，進行灌注培養(yǎng)。 所述旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基從篩面通過，細胞位于篩面外，在旋轉(zhuǎn) 過濾籠內(nèi)有吸取管，能夠?qū)⒒\內(nèi)的培養(yǎng)液栗出，從而達到調(diào)整培養(yǎng)液參數(shù)的目的。 所述使用聲頻灌流方法和旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法同時進行灌注培養(yǎng)具體指：將一個旋 轉(zhuǎn)過濾器（旋轉(zhuǎn)過濾灌注設(shè)備、Spin filter)按放在反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)軸上，同時在反應(yīng)器上 安裝聲頻灌流裝置，進行灌注培養(yǎng)。 所述使用聲頻灌流方法和旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法同時進行灌注培養(yǎng)的過程中，培養(yǎng)基 從篩面通過，細胞位于篩面外，在旋轉(zhuǎn)過濾籠內(nèi)有吸取管，能夠?qū)⒒\內(nèi)的培養(yǎng)液栗出，同時 基于聲頻引起細胞聚集的新型細胞截留裝置，是利用聲頻使細胞聚集后沉淀，促使胞液分 離，不僅截留效率高，而且不易堵塞，易于清洗和滅菌，而且在培養(yǎng)過程中，可以將部分細胞 碎片與上清液一起分離出反應(yīng)器。 本專利技術(shù)所提供的灌注培養(yǎng)方法可使用各種市售的旋轉(zhuǎn)過濾灌注設(shè)備和/或聲頻 灌流裝置，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)反應(yīng)體系的具體參數(shù)選擇合適的旋轉(zhuǎn)過濾灌注設(shè)備和/ 或聲頻灌流裝置用于灌注培養(yǎng)。 優(yōu)選的，所述步驟1中，批培養(yǎng)的培養(yǎng)體系體積為4. 9-5. 1L。 優(yōu)選的，所述步驟1中，接種后培養(yǎng)體系中的細胞密度為0. 6-1. 0*106個/ml。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)重組FVIII細胞株的種類選擇合適的培養(yǎng)條件進行批培 養(yǎng)，在本專利技術(shù)一實施例中，批培養(yǎng)的具體條件為溫度37°C、pH 6.9、溶氧（D0)30-50%、初始 轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/min。 優(yōu)選的，所述步驟2中，當培養(yǎng)體系中葡萄糖含量為0. 8-1. 2g/L時，使用旋轉(zhuǎn)過濾 灌注方法進入灌注培養(yǎng)模式。 優(yōu)選的，所述步驟2中，灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體系體積為4. 9-5. 1L。 優(yōu)選的，所述步驟2中，灌注培養(yǎng)模式期間，保持葡萄糖含量在0. 8-1. 2g/L。 優(yōu)選的，所述步驟2中，保持培養(yǎng)體系中的細胞密度在1-2*107個/ml。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)培養(yǎng)體系和反應(yīng)情況選取合適的方法從培養(yǎng)體系中抽取 部分細胞，以是培養(yǎng)體系的細胞密度維持在目標區(qū)間。 優(yōu)選的，所述步驟2中，灌注培養(yǎng)模式的培養(yǎng)時間為10-15天。 優(yōu)選的，所述步驟3中，灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體系體積為4. 9-5. 1L。 優(yōu)選的，所述步驟3中，維持細胞密度在2. 0-3. 0*107個/ml。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)培養(yǎng)體系和反應(yīng)情況選取合適的方法從培養(yǎng)體系中抽取 部分細胞，以是培養(yǎng)體系的細胞密度維持在目標區(qū)間。 優(yōu)選的，所述步驟3中，灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)時間為多60天。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)重組FVIII細胞株的種類選擇合適的培養(yǎng)條件進行灌注 培養(yǎng)，在本專利技術(shù)一實施例中，灌注培養(yǎng)的具體條件為溫度37°C、pH 6. 9、溶氧（DO) 30-50 %。 本專利技術(shù)第二方面提供所述高效表達重組八因子的灌注培養(yǎng)方法在凝血八因子制 備領(lǐng)域的用途。 本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)反應(yīng)體系的具體情況選取合適的提純方法對步驟3的反 應(yīng)液進行處理，制備獲得凝血八因子產(chǎn)品。 如上所述，本專利技術(shù)所提供的高效表達重組八因子的灌注培養(yǎng)方法采用聲頻灌流方 法和旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法相結(jié)合灌流培養(yǎng)，先將擴增所得的重組FVIII細胞株的種子接種并 進行批培養(yǎng)，待反應(yīng)器內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗到一定水平（以檢測葡萄糖含量為衡量標準），先打 開旋轉(zhuǎn)過濾灌注設(shè)備進入灌注培養(yǎng)模式，而后到達一定細胞密度后再打開聲頻灌流裝置進 行雙系統(tǒng)灌注培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過程中不定期抽去部分細胞，使反應(yīng)器內(nèi)的細胞保持一個合 適的細胞密度。本專利技術(shù)所提供的灌注培養(yǎng)方法取兩種細胞截留方式的長處，互補不足之處， 發(fā)揮最大的灌流效率。在細胞增殖生長期，先使用旋轉(zhuǎn)過濾灌注設(shè)備進行灌注培養(yǎng)，可以避 免聲頻灌流裝置在低密度條件下將細胞過多的帶出反應(yīng)器中，導(dǎo)致細胞數(shù)量有一個驟減的 過程。而后達到一定細胞密度后，打開聲頻灌流裝置，可以同時利用兩個截留系統(tǒng)進行灌注 培養(yǎng)，一方面有了旋轉(zhuǎn)過濾灌注設(shè)備，使得可以讓聲頻灌流裝置在有效范圍內(nèi)達到最優(yōu)的 灌本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種高效表達重組八因子的灌注培養(yǎng)方法，包括如下步驟：1)將重組FVIII細胞株的種子接種于反應(yīng)器中進行批培養(yǎng)；2)當培養(yǎng)體系中葡萄糖含量為0.5?1.5g/L時，使用旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法進入灌注培養(yǎng)模式；3)當反應(yīng)器內(nèi)的細胞處于一個穩(wěn)態(tài)階段，使用聲頻灌流方法和旋轉(zhuǎn)過濾灌注方法同時進行灌注培養(yǎng)，維持細胞密度在2?3*107個/ml。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：程露，鄭繼岱，陸暉，周雪峰，
申請(專利權(quán))人：上海萊士血液制品股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31
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