誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法及肝細胞技術

本發明專利技術涉及一種誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法及肝細胞。該方法通過在定向誘導分化的不同階段加入不同的培養基進行誘導性多能干細胞的定向誘導分化。該方法在操作過程中可以隨時觀察細胞形態的變化，確保誘導的正常進行，可以快捷且高效地誘導出所需的肝臟前體細胞。該誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法采用無飼養層細胞的培養體系，僅通過加入相應階段的誘導培養基就能獲得肝細胞，且經過檢測，純度較高。通過使用上述誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，誘導周期較短、效率高，且得到的肝細胞性能穩定，功能成熟，不存在基質細胞污染的問題。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及細胞工程領域，尤其是涉及一種誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法及肝細胞。
技術介紹
異體肝臟移植被認為是目前治療終末期肝病的最有效手段，移植后長期生存率可達70％-85％。然而有限的肝臟供體遠遠不能滿足臨床需求，據報道，等待肝移植的患者在等待期病死亡率達15％。目前針對肝功能衰竭的其他治療方法包括通過膜濾或樹脂交換作用的體外人工肝、體外應用同種或異種肝細胞的生物人工肝以及體內肝細胞移植等。上世紀70年代以細胞為基礎治療引起廣泛關注，人胎肝治療有著很好的臨床的效果。向德棟等選取了40例慢性重型乙型肝炎患者，均有不同程度的乏力、納差、腹脹等消化道癥狀，在20例患者中采用非生物人工肝聯合肝胎細胞懸液治療重型肝炎，有8例患者病情自然恢復，4例患者成功過度行肝移植治療，好轉存活率達60％，采用單純非生物人工肝支持治療好轉存活率僅為45％，其療效不如非生物人工肝聯合肝胎細胞懸液治療。鄭宣鶴等采用血漿置換聯合胎肝細胞懸液治療138例患者，臨床好轉存活99例，有效提高了重型肝炎患者的好轉治愈率，療效優于單用胎肝細胞懸液或血漿置換組，而單用血漿置換組與單用肝胎細胞懸液組差異無顯著性，該結果與大島宣雄等單用血漿置換治療117例患者，存活率僅24％等報道結果相符。但是因胎肝來源等存在倫理問題，人胎肝治療已被禁止。有研究表明通過對慢性肝衰竭患者進行MSC(MesenchymalStemCell，間充質干細胞)移植，可以改善肝功能和臨床癥狀，且未出現嚴重不良反應。并且MSC不表達MHC-Ⅱ類分子，低表達甚至不表達MHC-Ⅰ類分子，幾乎不存在免疫排斥問題。但是自體骨髓MSC也具有一定的局限性：如患者凝血功能差影響骨髓采集、患者自體細胞數量不足及增殖活性低下，因而限制了臨床應用。隨著2007年11月，美國和日本的兩個研究小組幾乎同時宣布成功將人體皮膚細胞改造成幾乎可以和胚胎干細胞相媲美的誘導性多能干細胞---“iPS細胞”，回避了歷來已久的倫理爭議，解決了干細胞移植免疫排斥問題，在生命科學基礎研究和醫學領域的優勢已日趨明顯。
技術實現思路
基于此，有必要提供一種誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法及肝細胞。一種誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，包括如下步驟：步驟S1，提供或制備誘導性多能干細胞；步驟S2，將所述誘導性多能干細胞初始培養在添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM-1640培養基中，并在培養過程中更換添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM-1640培養基，使所述誘導性多能干細胞向限定性內胚層誘導分化；步驟S3，將步驟S2培養得到的細胞初始培養在添加有角質細胞生長因子和胎牛血清的KO/DMEM培養基中，并在培養過程更換添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇及二甲基亞砜的KO/DMEM培養基，使培養的細胞向肝系細胞定向誘導分化；步驟S4，將步驟S3培養得到的細胞培養在添加有胎牛血清、肝細胞生長因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培養基中，促進肝細胞成熟。在其中一個實施例中，在所述步驟S1中，采用病毒感染、質粒轉染、mRNA導入、miRNA導入或化學分子添加方式將誘導因子導入人類細胞中，誘導所述人類細胞分化為誘導性多能干細胞；所述誘導因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。在其中一個實施例中，在所述步驟S2中，使用所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM-1640培養基培養22-50小時后，更換使用所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM-1640培養基培養46-98小時，并且在后續培養過程中每22-26小時更換一次培養基。在其中一個實施例中，所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM-1640培養基中所述人活化素A的濃度為5-300ng/ml，所述Wnt3a的濃度為20-100ng/ml。在其中一個實施例中，所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM-1640培養基中所述人活化素A的濃度為10-200ng/ml，所述胎牛血清的體積濃度為0.2-2％。在其中一個實施例中，在所述步驟S3中，使用所述添加有角質細胞生長因子和胎牛血清的KO/DMEM培養基培養22-98小時后，再使用添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇及二甲基亞砜的KO/DMEM培養基培養118-170小時，并且在培養過程中，每隔22-26小時更換一次相應的培養基。在其中一個實施例中，所述添加有角質細胞生長因子和胎牛血清的KO/DMEM培養基中所述角質細胞生長因子的濃度為15-100ng/ml，所述胎牛血清的體積濃度為2-3％。在其中一個實施例中，所述添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇及二甲基亞砜的KO/DMEM培養基中所述血清替代物的體積濃度為20％，所述L-谷氨酰胺的濃度為1-3mM，所述非必需氨基酸的質量濃度為0.1-15％，所述β-巰基乙醇的濃度為0.1-0.12mM，所述二甲基亞砜的體積濃度為0.2-2％。在其中一個實施例中，在所述步驟S4中，培養周期為142-242小時，且每個22-26小時更換一次培養基。在其中一個實施例中，所述添加有胎牛血清、肝細胞生長因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培養基中所述胎牛血清的體積濃度為10％，所述肝細胞生長因子的濃度為10-300ng/ml，所述抑瘤素的濃度為1-150ng/ml，所述地塞米松的濃度為0.05-1.2μM，所述L-谷氨酰胺的濃度為2-3mM。本專利技術還提供了一種采用上述任一實施例所述的誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法構建得到的肝細胞。本專利技術通過合理的使用細胞生長因子提供一種優化的誘導性多能干細胞在體外條件下定向誘導分化為肝臟前體細胞的方法，該方法在操作過程中可以隨時觀察細胞形態的變化，確保誘導的正常進行，可以較為快捷且高效地誘導出所需的肝臟前體細胞。該誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法采用無feeder(飼養層細胞)的培養體系，僅通過加入相應階段的誘導培養基就能獲得肝細胞，且經過檢測，純度較高。通過使用上述誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，誘導周期較短、效率高，且得到的肝細胞性能穩定，不存在基質細胞污染的問題。附圖說明圖1為本專利技術實施例中hiPS誘導形成過程中細胞形態變化示意圖，其中，A：人胚胎成纖維細胞，B：病毒本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟S1，提供或制備誘導性多能干細胞；步驟S2，將所述誘導性多能干細胞初始培養在添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM?1640培養基中，并在培養過程中更換添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM?1640培養基，使所述誘導性多能干細胞向限定性內胚層誘導分化；步驟S3，將步驟S2培養得到的細胞初始培養在添加有角質細胞生長因子和胎牛血清的KO/DMEM培養基中，并在培養過程更換添加有血清替代物、L?谷氨酰胺、非必需氨基酸、β?巰基乙醇及二甲基亞砜的KO/DMEM培養基，使培養的細胞向肝系細胞定向誘導分化；步驟S4，將步驟S3培養得到的細胞培養在添加有胎牛血清、肝細胞生長因子、抑瘤素、地塞米松及L?谷氨酰胺的L?15培養基中，促進肝細胞成熟。

【技術特征摘要】
1.一種誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，其特征在于，包
括如下步驟：
步驟S1，提供或制備誘導性多能干細胞；
步驟S2，將所述誘導性多能干細胞初始培養在添加有人活化素A和Wnt3a
的RPTM-1640培養基中，并在培養過程中更換添加有人活化素A及胎牛血清的
RPTM-1640培養基，使所述誘導性多能干細胞向限定性內胚層誘導分化；
步驟S3，將步驟S2培養得到的細胞初始培養在添加有角質細胞生長因子和
胎牛血清的KO/DMEM培養基中，并在培養過程更換添加有血清替代物、L-谷
氨酰胺、非必需氨基酸、β-巰基乙醇及二甲基亞砜的KO/DMEM培養基，使培
養的細胞向肝系細胞定向誘導分化；
步驟S4，將步驟S3培養得到的細胞培養在添加有胎牛血清、肝細胞生長因
子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培養基中，促進肝細胞成熟。
2.如權利要求1所述的誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，
其特征在于，在所述步驟S1中，采用病毒感染、質粒轉染、mRNA導入、miRNA
導入或化學分子添加方式將誘導因子導入人類細胞中，誘導所述人類細胞分化
為誘導性多能干細胞；所述誘導因子包括OCT4、SOX2、NANOG及Lin28。
3.如權利要求1所述的誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，
其特征在于，在所述步驟S2中，使用所述添加有人活化素A和Wnt3a的
RPTM-1640培養基培養22-50小時后，更換使用所述添加有人活化素A及胎牛
血清的RPTM-1640培養基培養22-50小時，并且在后續培養過程中每22-50小
時更換一次培養基。
4.如權利要求1或3所述的誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方
法，其特征在于，所述添加有人活化素A和Wnt3a的RPTM-1640培養基中所
述人活化素A的濃度為5-300ng/ml，所述Wnt3a的濃度為20-100ng/ml。
5.如權利要求4所述的誘導性多能干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，
其特征在于，所述添加有人活化素A及胎牛血清的RPTM-1640培養基中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孫懿，林戈，盧光琇，
申請(專利權)人：湖南光琇高新生命科技有限公司，
類型：發明
國別省市：湖南;43