一種固液相結合制備西那普肽的方法技術

本發明專利技術涉及多肽合成領域，特別涉及一種固液相結合制備西那普肽的方法。本發明專利技術提供的方法如下：首先制備多肽片段Ⅰ：Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-OH，然后采用Fmoc固相合成法向載體樹脂上依次偶聯四個多肽片段Ⅰ，最后偶聯保護氨基酸Lys，經裂解反應后制得西那普肽。采用本方法制備西那普肽僅需經過五步接肽反應，生產周期短，粗肽純度高，生產成本低，操作簡便，適宜進行工業化生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及多肽合成領域，特別涉及一種固液相結合制備西那普肽的方法。
技術介紹
新生兒呼吸窘迫綜合征(RDS)是指新生兒出生后不久即出現進行性呼吸困難和呼吸衰竭等癥狀，主要是由于缺乏肺泡表面活性物質所引起，導致肺泡進行性萎陷，患兒于生后4-12小時內出現進行性呼吸困難、呻吟、發紺、吸氣三凹征，嚴重者發生呼吸衰竭。發病率與胎齡有關，胎齡越小，發病率越高，體重越輕，病死率越高。2012年3月6日，DiscoveryLaboratories公司的氣管內懸液Surfaxin(Lucinactant，蘆西納坦)獲得美國食品藥品管理局(FDA)批準，用于治療早產兒呼吸窘迫綜合征。Surfaxin是在西那普肽的基礎上根據天然人肺表面活性劑的特點設計而成的產品，用于模擬人肺表面活化蛋白B(SP-B)。西那普肽，英文名稱為Sinapultide，分子量2469.40，是一種人工設計的含有21個氨基酸的多肽分子，其結構如下：目前國內關于西那普肽的合成方法主要有基因重組法和化學法。其中美國專利US5260273采用基因重組技術合成西那普肽，但該方法操作繁瑣，且技術要求及生產成本極高，不利于進行工業化大規模生產，最重要的是，一旦重組基因DNA分子鏈上的核苷酸發生突變，則會造成肽鏈上相應的氨基酸突變，降低了藥品的純度和使用安全性。中國專利CN102850440A是國內首個有關西那普肽合成方法的專利，采用了片段合成的方法。該方法首先通過固相合成的方法合成片段肽樹脂Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-樹脂，然后再逐步偶聯以固相法制得的中間體Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-OH，制得KLLLLKLLLLKLLLLKLLLL肽樹脂，裂解后得西那普肽類似物，該專利采用固相法制備多肽片段，需要耗用大量昂貴的載體樹脂，生產成本較高，并且在合成片段Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-OH過程中，容易產生雜質Fmoc-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH，進而導致終產品中含有Lys側鏈氨基偶聯上片段H-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-OH的雜質。中國專利CN104098656A采用Fmoc固相合成法，依次偶聯每一位保護氨基酸，獲得保護21肽樹脂，經裂解反應制得西那普肽，產率為47.9％。此方法生產周期較長，經歷多步接肽反應，粗肽純度較低，導致總收率較低，生產成本高。中國專利CN104817631A介紹了一種首先通過Fmoc固相合成法合成Fmoc-Lys(Boc)-樹脂，然后交替偶聯保護片段Fmoc-(Leu)4-OH與保護氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，制得西那普肽肽樹脂，最后經裂解反應制得西那普肽的方法。此方法仍需經歷多步接肽反應，粗品純度較低，產率在52.3％-57.1％之間，生產周期較長，生產成本高。綜上所述，目前報道的西那普肽合成方法中，均存在生產周期較長，生產成本高的問題，不利于放大生產，產率較低的問題。
技術實現思路
為解決上述西那普肽合成過程中存在的問題，本專利技術提供一種固液相結合制備西那普肽的方法：首先采用液相法制備多肽片段Ⅰ：Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-OH，然后采用Fmoc固相合成法向載體樹脂上依次偶聯四個多肽片段Ⅰ，最后偶聯保護氨基酸Lys，經裂解反應后制得西那普肽。采用本方法制備西那普肽僅需經過五步接肽反應，生產周期短，粗肽純度高，收率高，同時大大降低了生產成本，適宜進行工業化生產。為實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：一種固液相結合制備西那普肽的方法，包括如下步驟：(a)制備多肽片段Ⅰ：Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-OH；(b)采用Fmoc固相合成法向載體樹脂上依次偶聯步驟(a)中的多肽片段Ⅰ依次偶聯4次后，然后偶聯保護氨基酸Lys，制備西那普肽肽樹脂；(c)西那普肽肽樹脂經裂解反應制備西那普肽粗肽；(d)西那普肽粗肽經純化過程制備西那普肽精肽。其中，步驟(a)中，多肽片段Ⅰ的制備過程為：(1)合成Boc-Leu-OSu：Boc-Leu-OH與HOSu在有機溶劑中，以DCC為活化劑，反應制備Boc-Leu-OSu；其中Boc-Leu-OH和HOSu的摩爾比為1:1.0～1.2；Boc-Leu-OH和DCC的摩爾比為1:1.0～1.2；(2)合成H-Leu-Leu-OH：H-Leu-OH和Boc-Leu-OSu在碳酸鈉溶液中反應，制備Boc-Leu-Leu-OH，然后經TFA處理，制備H-Leu-Leu-OH；其中H-Leu-OH和碳酸鈉的摩爾比為1：1.0～2.0；H-Leu-OH和Boc-Leu-OSu的摩爾比為1:1.1～1.5；(3)合成Fmoc-Leu-OSu：Fmoc-Leu-OH與HOSu在有機溶劑中，以DCC為活化劑，反應制備Fmoc-Leu-OSu；其中Fmoc-Leu-OH和HOSu的摩爾比為1:1.0～1.2；Fmoc-Leu-OH和DCC的摩爾比為1:1.0～1.2；(4)Fmoc-Leu-Leu-OH的制備：H-Leu-OH和Fmoc-Leu-OSu在碳酸鈉溶液中反應，制備Fmoc-Leu-Leu-OH；其中H-Leu-OH和碳酸鈉的摩爾比為1：1.0～2.0；H-Leu-OH和Fmoc-Leu-OSu的摩爾比為1:1.1～1.5；(5)Fmoc-Leu-Leu-OSu的制備：Fmoc-Leu-Leu-OH與HOSu在有機溶劑中，以DCC為活化劑，反應制備Fmoc-Leu-Leu-OSu；其中Fmoc-Leu-Leu-OH和HOSu的摩爾比為1:1.0～1.2；Fmoc-Leu-Leu-OH和DCC的摩爾比為1:1.0～1.2；(6)Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH的制備：H-Leu-Leu-OH和Fmoc-Leu-Leu-OSu在碳酸鈉溶液中反應，制備Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH；其中H-Leu-Leu-OH和碳酸鈉的摩爾比為1：1.0～2.0；H-Leu-Leu-OH和Fmoc-Leu-Leu-OSu的摩爾比為1:1.1～1.5；(7)Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OSu的制備：Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH與HOSu在有機溶劑中，以DCC為活化劑反應制備Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OSu；其中Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種固液相結合制備西那普肽的方法，其特征在于，包括如下步驟：(a)液相法制備多肽片段Ⅰ：Fmoc?Leu?Leu?Leu?Leu?Lys(Boc)?OH；(b)采用Fmoc固相合成法向載體樹脂上偶聯步驟(a)中的多肽片段Ⅰ，依次偶聯四次后再與保護氨基酸Lys進行偶聯，制備西那普肽肽樹脂；(c)西那普肽肽樹脂經裂解反應制備西那普肽粗肽；(d)西那普肽粗肽經純化過程制備西那普肽精肽。

【技術特征摘要】
1.一種固液相結合制備西那普肽的方法，其特征在于，包括如下步驟：
(a)液相法制備多肽片段Ⅰ：Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-OH；
(b)采用Fmoc固相合成法向載體樹脂上偶聯步驟(a)中的多肽片段Ⅰ，
依次偶聯四次后再與保護氨基酸Lys進行偶聯，制備西那普肽肽樹脂；
(c)西那普肽肽樹脂經裂解反應制備西那普肽粗肽；
(d)西那普肽粗肽經純化過程制備西那普肽精肽。
2.根據權利要求1所述的一種固液相結合制備西那普肽的方法，其特征在于，步
驟(a)中，多肽片段Ⅰ的制備過程為：
(1)合成Boc-Leu-OSu：Boc-Leu-OH與HOSu在有機溶劑中，以DCC為
活化劑，反應制備Boc-Leu-OSu；所述Boc-Leu-OH和HOSu的摩爾比為1:1.0～1.2；
所述Boc-Leu-OH和DCC的摩爾比為1:1.0～1.2；
(2)合成H-Leu-Leu-OH：H-Leu-OH和Boc-Leu-OSu在碳酸鈉溶液中反
應，制備Boc-Leu-Leu-OH，然后經TFA處理，制備H-Leu-Leu-OH；所述H-Leu-OH
和碳酸鈉的摩爾比為1：1.0～2.0；所述H-Leu-OH和Boc-Leu-OSu的摩爾比為
1:1.1～1.5；
(3)合成Fmoc-Leu-OSu：Fmoc-Leu-OH與HOSu在有機溶劑中，以DCC
為活化劑，反應制備Fmoc-Leu-OSu；所述Fmoc-Leu-OH和HOSu的摩爾比為
1:1.0～1.2；所述Fmoc-Leu-OH和DCC的摩爾比為1:1.0～1.2；
(4)Fmoc-Leu-Leu-OH的制備：H-Leu-OH和Fmoc-Leu-OSu在碳酸鈉溶
液中反應，制備Fmoc-Leu-Leu-OH；所述H-Leu-OH和碳酸鈉的摩爾比為1：1.0～
2.0；所述H-Leu-OH和Fmoc-Leu-OSu的摩爾比為1:1.1～1.5；
(5)Fmoc-Leu-Leu-OSu的制備：Fmoc-Leu-Leu-OH與HOSu在有機溶劑
中，以DCC為活化劑，反應制備Fmoc-Leu-Leu-OSu；所述Fmoc-Leu-Leu-OH
和HOSu的摩爾比為1:1.0～1.2；所述Fmoc-Leu-Leu-OH和DCC的摩爾比為
1:1.0～1.2；
(6)Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH的制備：H-Leu-Leu-OH和
Fmoc-Leu-Leu-OSu在碳酸鈉溶液中反應，制備Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH；所
述H-Leu-Leu-OH和碳酸鈉的摩爾比為1：1.0～2.0；所述H-Leu-Leu-OH和
Fmoc-Leu-Leu-OSu的摩爾比為1:1.1～1.5；
(7)Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OSu的制備：Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH與
HOSu在有機溶劑中，以DCC為活化劑反應制備Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OSu；
所述Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH和HOSu的摩爾比為1:1.0～1.2；所述
Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-OH和DCC的摩爾比為1:1.0～1.2；
(8)Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張穎，王德龍，王仁友，李同金，石鑫磊，
申請(專利權)人：濟南康和醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：山東;37