雞血抗菌肽的制備方法技術

本發明專利技術公開了雞血抗菌肽的制備方法。該方法包括如下步驟：(1)取雞血，進行血細胞破碎后加入菠蘿蛋白酶進行酶解；(2)向酶解液中加入乙酸浸提，離心取上清，調節pH至6.0±0.5，獲得雞血抗菌肽粗提物；(3)雞血抗菌肽粗提物純化；(4)冷凍干燥。實驗證明，利用本發明專利技術的方法從雞血中提取的抗菌肽對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、綠膿桿菌等常見的致病菌有明顯的抑制作用。本發明專利技術為生產抗菌肽提供了一個新的途徑和方法。本發明專利技術方法具有操作方便快捷、設備簡單、分離提取率高、成本低的優點，可應用于大規模地從新鮮雞血中分離純化抗菌肽的生產。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物
，特別涉及。
技術介紹
抗菌肽原指昆蟲體內經誘導而產生的一類分子量在4KD左右，具有抗菌活性的堿性多肽物質。迄今為止，在不同動物組織中已發現了很多具有抗菌作用的蛋白質和多肽，已有70多種抗菌多肽的結構被測定，抗菌肽的概念得到了極大的擴展。抗菌肽是生物體內誘導表達具有廣譜抗菌活性的小分子多肽。這些多肽是生物體非專一性的免疫應答產物，是生物體內免疫系統的重要成分。國內外關于雞源抗菌肽的研究，主要針對雞小腸中的抗菌肽，而血中抗菌肽的提取及抗菌活性研究在國內外卻很少有報道。目前，我國雞的飼養量很大，屠宰雞的下腳料雞血很多，對其進行抗菌肽的提取和研究，是對資源的利用和再開發，是很有必要的。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供，其制備方法條件溫和、無污染、效率高。為了實現上述目的，本專利技術提出如下技術方案: ，該方法包括以下步驟: (1)取雞血，進行血細胞破碎(目的是釋放血紅蛋白)后加入菠蘿蛋白酶進行酶解； (2)向酶解液中加入乙酸浸提，離心取上清，調節pH至6.0±0.5(如6.0)，獲得雞血抗菌肽粗提物； (3)將所述雞血抗菌肽粗提物上樣于S印hadexG-100凝膠柱，采用洗脫液進行洗脫，收集具有抗菌活性的洗脫峰； (4)將步驟(3)收集的具有抗菌活性的洗脫峰上樣于SephadexG_25凝膠柱，采用洗脫液進行洗脫，收集洗脫峰，獲得雞血抗菌肽溶液； (5)將步驟(4)收集的雞血抗菌溶液冷凍干燥。在所述方法的步驟(1)中，所述菠蘿蛋白酶與所述雞血的配比可為750-35000U:100ml (如 1750-3500U:100ml，具體如 3500U: 100mL);所述酶解的溫度可為 70 ?90°C (如70°C )，時間可為4?6h(如4h)。另外，在本專利技術中，所述進行血細胞破碎具體通過采用組織搗碎機攪拌所述雞血實現的。在本專利技術中，所述菠蘿蛋白酶的酶活為3500U/mg。相應的，所述菠蘿蛋白酶與所述雞血的配比可為 0.5-lOmg:100ml (如 0.5_lmg:100ml，具體如 lmg: 100mL)。在所述方法的步驟(2)中，所述向酶解液中加入乙酸具體可為:向所述酶解液中加入等體積的5% (體積百分含量)的乙酸水溶液；所述浸提具體可為:4?37°C (如4°C?10°C，再如 4°C )震蕩 16-20h(如 16h);所述離心為:6600g-10000g(如 10000g)4?1CTC (如 4°C )離心 20min ?30min(如 20min)。在所述方法的步驟(3)中，所述洗脫液具體可為:pH為6.0的濃度為0.2mOl/L的乙酸鈉水溶液；所述洗脫的速度具體可為10.0mL/cm2.h。在本專利技術的一個實施例中，步驟(3)的洗脫過程中共產生兩個洗脫峰，所述具有抗菌活性的洗脫峰實際為第二個洗脫峰。所述抗菌活性具體體現為抗如下細菌中的至少一種:大腸桿菌(如ACTT 25922)、綠膿桿菌(如ACTT 27853)、嗜水氣單胞菌(GenebankIDSequence ID:gb|KJ156374.11)。在所述方法的步驟(4)中，所述洗脫液具體可為:pH為6.0的濃度為0.2mOl/L的乙酸鈉水溶液；所述洗脫的速度具體可為10.0mL/cm2.h。在本專利技術的一個實施例中，步驟(4)的洗脫過程中只產生一個洗脫峰，該洗脫峰即為純化后的雞血抗菌肽樣品。在所述方法的步驟(3)中，Sephadex G-100凝膠柱的柱長度和柱內徑比為8:1。具體而言，本專利技術中所采用的Sephadex G-100凝膠柱為Pharmacia公司產品，其產品目錄號為17-0061-02)。所述上樣的上樣量為10ml ;所述洗脫的洗脫體積為1_1.5L。在所述方法的步驟(4)中，Sephadex G_25凝膠柱的柱長度和柱內徑比為8:1。具體而言，本專利技術中所采用的Sephadex G_25凝膠柱為Pharmacia公司產品，其產品目錄號為17-0033-1。所述上樣的上樣量為10ml ;所述洗脫的洗脫體積為1_1.5L。在上述方法中，所述雞血即可為新鮮的雞血，也可以為經冷凍后融化的雞血。利用如上所述方法提取得到的雞血抗菌肽也屬于本專利技術的保護范圍。具體而言，本專利技術具有以下優點: 1、本專利技術方法實現了從雞血中提取具有較強抗菌活性的多肽物質，為生產抗菌肽提供了一個新的途徑和方法。2、采用本專利技術方法提取的抗菌肽，屬于天然提取物，具有天然、無毒、無污染、無殘留、無副作用、高效抗菌、抗病毒、促生長和調節免疫等廣泛而穩定的功能特點。3、與同類方法相比，本專利技術方法操作方便，設備簡單，提取周期短，而且分離提取率高。4、本專利技術所開發產品的原料來源豐富，生產成本低，可以使雞血得到高值化利用。因此本專利技術的應用不僅可以帶來良好的經濟效益，而且還具有良好的生態效益，進而還具有重要的公共衛生學意義，符合構建節約環保型社會的理念。【具體實施方式】下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1 1、從雞屠宰場收集新鮮雞血，組織搗碎機攪拌均勻(同樣可以將采集的雞血冷凍待用時融化后再按上步驟進行)，此步驟的目的是破碎血細胞，釋放血紅蛋白，凍融之后效果更佳。2、向步驟1處理過的雞血中加入菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶與雞血的配比為lmg木瓜蛋白酶/100ml雞血原液，混勻，在70°C條件下酶解4h，以得到酶解液。3、向步驟2的酶解液加入等體積的5%乙酸(體積百分含量，溶劑為水)，4°C震蕩浸提16h，8000r/min(相當于10000g)4°C離心20min，留取上清，調其pH值至6.0，即為雞血抗菌肽的粗提物。4、4°C下將雞血抗菌肽粗提物上樣于Sephadex G-100凝膠柱(柱長與內徑比為 8:1, Sephadex G-100凝膠柱為Pharmacia公司產品，其產品目錄號為17-0061-02)進行層析，上樣量為10ml，洗脫液為pH為6.0的濃度為0.2mol/L的乙酸鈉水溶液，洗脫的速度為10.0mL/cm2.h，洗脫體積為1L。核酸蛋白檢測儀檢測，自動收集器收集后，記錄儀記錄。雞血粗提物經S印hadex G-100凝膠柱層析后出現2個洗脫峰。將洗脫峰各收集管的組分取20 μ L進行抑菌試驗。采用瓊脂糖彌散方法(檢測菌在瓊脂平板上 的終濃度為106CFU/ml)對收集的洗脫液進行檢測，檢測收集液對大腸桿菌ACTT25922株的抗菌作用，以等體積的20000IU的青鏈霉素溶液替代抗菌肽作為陽性對照，以及以等體積的0.2mol/L的醋酸鈉洗脫液替代抗菌肽作為陰性對照。收集具有抑菌作用的洗脫液。5、將步驟4獲得的有效的抗菌肽(合并的具有抑菌作用的洗脫液，即經SephadexG-100凝膠柱層析后收集的第9_16管)濃縮之后進一步用Sephadex G-25凝膠柱(柱長與內徑比為8:1，本專利技術中所采用的Sephadex G_25凝膠柱為Pharmacia公司產品，其產品目錄號為17-0033-1)進行層析，上樣量為10ml，洗脫液為pH為6.0的濃度為0.2mol/L的乙酸鈉水溶液，洗脫的速度為10.0mL/cm2.h，洗本文檔來自技高網...

【技術保護點】
雞血抗菌肽的制備方法，包括如下步驟：(1)?取雞血，進行血細胞破碎后加入菠蘿蛋白酶進行酶解；(2)?向酶解液中加入乙酸浸提，離心取上清，調節pH?至6.0±0.5，獲得雞血抗菌肽的粗提物；(3)?將所述雞血抗菌肽的粗提物上樣于Sephadex?G?100?凝膠柱，采用洗脫液進行洗脫，收集具有抗菌活性的洗脫峰；(4)?將步驟(3)?收集的具有抗菌活性的洗脫峰上樣于Sephadex?G?25?凝膠柱，采用洗脫液進行洗脫，收集洗脫峰，獲得所述雞血抗菌肽溶液；(5)?將步驟(4)收集的雞血抗菌肽溶液冷凍干燥。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：不公告發明人，
申請(專利權)人：重慶三零三科技有限公司，
類型：發明
國別省市：重慶;85