一株產纖溶酶的海洋放線菌株、用途以及由其制備的纖溶酶及纖溶酶的應用制造技術

本發明專利技術公開了一株可產生纖溶酶的海洋放線菌菌株、其制備方法和用途以及尤其制備的纖溶酶及纖溶酶的用途。該菌株來自于渤海灣淤泥，通過16SrRNA鑒定為鏈霉菌屬放線菌（Streptomyces?sp.），其保藏編號為CGMCC?No.10664。該株放線菌可以采用液體培養發酵生產纖溶酶，纖溶酶是臨床治療血栓疾病的主要藥物之一，該纖溶酶分子量小，纖維蛋白特異性強，不易產生出血反應，在治療血栓性疾病上有較好的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一株海洋放線菌及其應用，屬于生物工程

技術介紹
血栓性疾病嚴重危害人類健康，其致死率和死亡率較高。目前臨床應用的溶栓劑存在一定缺陷，有的毒副作用強，有的半衰期短，價格昂貴等，比如蝮蛇抗栓酶和蚓激酶來源緊缺、價格昂貴、不易保存，尿激酶(UK)具有出血傾向，鏈激酶(SK)和葡激酶(SaK)具有抗原性。因而，開發治療血栓性疾病的藥物成為了當前國內外醫學研究的重點和熱點，相關藥物具有巨大的發展潛力和應用前景。海洋蘊藏著豐富的微生物資源，由于海洋的高鹽、低溫、低營養等特殊環境，海洋微生物可產生大量化學結構新穎、甚至有特殊作用的生物活性物質，具有極高的應用價值。放線菌是海洋微生物中的一個重要組成部分，海洋放線菌活性物質的研究是海洋微生物產物中值得關注的一個熱點。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種可產生纖溶酶的海洋放線菌菌株、其制備方法和用途以及尤其制備的纖溶酶及纖溶酶的用途。為解決上述技術問題，本專利技術所采取的技術方案是：一種海洋放線菌MY0504，該菌于2015年3月25日于中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏，其保藏編號為CGMCCNo.10664。海洋放線菌MY0504對多種抗生素敏感；小鼠急毒實驗安全無毒性，該菌株對多種抗生素敏感。進一步的，本專利技術所述的海洋放線菌MY0504在制備纖溶酶中的用途。進一步的，所述纖溶酶的制備方法，如下：發酵菌接入LB海水培養基后進行發酵培養，發酵液的提取純化獲得纖溶酶；所述的發酵菌為海洋放線菌MY0504；所述的LB海水培養基的組成為：蛋白胨10g·L-1，酵母浸粉5g·L-1，pH7.0-7.2，余量的海水或模擬海水。三角瓶培養基裝量100mL/500mL，25℃培養3-4天，搖床轉速140r/min，以尿激酶為標準對照，纖溶酶發酵水平約500U/mL。進一步的，通過上述制備方法制備的纖溶酶，具有下述特性：其分子量約15KD；該纖溶酶具有分子量小，具有纖維蛋白特異性強的功能。進一步的，所述的纖溶酶可用于制備溶栓劑，并用于治療血栓性疾病。采用上述技術方案所產生的有益效果在于：1、本專利技術的鏈霉菌屬放線菌MY0504通過液體深層發酵培養，胞外產物含有纖溶性蛋白酶，活性達到500U/mL，可以用于血栓病的治療應用。2、本專利技術的鏈霉菌屬放線菌MY0504獲得的包括菌體和胞外分泌的菌液以及僅含胞外分泌物的菌液進行小鼠急毒試驗，結果安全無毒性(具體試驗情況參見實施方式)；同時發現該菌株對多種抗生素敏感，在實驗和生產過程中，對環境和操作人員安全可靠。附圖說明圖1為菌株MY0504在16SrRNA基因系統發育樹中的位置；圖2為菌株MY0504在電鏡下的孢子生長狀態；圖3是菌株MY0504發酵液酶活示意圖；圖4是重鉻酸鉀對海泥菌落的抑制作用的示意圖。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。本專利技術為一株海洋放線菌為鏈霉菌屬放線菌MY0504(Streptomycessp.)，該菌株已于2015年3月25日保藏于中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.10664，保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。該菌株是從渤海海域海水中篩選出的。實施例1、菌株MY0504分離篩選一、海水和海泥樣本的保存：海水取樣每瓶200ml，先冷藏，然后每瓶分裝到滅菌離心管(50ml)，取一瓶進行實驗，其余液氮保存，以備重復或進一步篩查。二、樣本的預處理從不同瓶的海水樣本中分別吸取1ml，每10個瓶取10ml，合并混勻，備用；海泥樣本或動物帶泥沙分別稱重約10g混合，再與模擬海水比例1:5(W/W)混合，搖床振蕩30min，備用。三、蛋白酶菌株初篩取海泥樣本分別加入滅菌的K2Cr2O7(重鉻酸鉀)溶液使濃度達到800μg/ml在25℃振蕩8小時，涂蛋白酶培養基(LB固體培養基加入0.5％的滅菌奶粉)平板，25℃培養2-5天，觀察菌落透明圈，挑取透明圈大的菌落接入試管保存。重鉻酸鉀濃度對海泥菌落中細菌數量有一定的抑制作用，可以去除一大部分的干擾菌落，具體可參見圖4。四、產纖溶酶的菌株條件篩選將篩選得到有蛋白酶活性的菌落分別劃線接種到纖溶酶篩選培養基(纖維蛋白原80mg溶于75mlPBS溶液(0.2mol/L磷酸鹽)中，凝血酶4mg溶于5ml同樣緩沖液中。將100mlLB培養基化開，冷卻到50℃，將纖維蛋白原溶液先加入，攪拌，然后加入凝血酶，攪拌均勻。迅速倒平板，備用)中，觀察菌落透明圈，挑取透明圈大的菌落進行初步分類，根據外觀和鏡檢的結果可以初步判斷放線菌。五、常用抗生素對目標菌株的抑制作用實驗將MY0504菌株的孢子用接種環挑取少部分在10ml無菌水中稀釋，高速搖勻，備用。將100mlPB培養基化開降溫到45℃左右，加入2ml備用的孢子菌液，搖勻，鋪平板。配制如下抗生素的溶液(濃度見表1)：青霉素、四環素、環丙沙星、慶大霉素、桿菌肽。取10μL點到上述平板上，24℃恒溫培養3天，測定抑菌圈的大小。抗生素周邊某一直徑的抑菌圈表示對藥物敏感，小于或根本沒有說明該菌株對抗生素有抗性。采用Kirby-Bauer的檢測方法，參照各抗生素的敏感直徑得出MY0504的敏感程度如表1。可以看出，該菌株對這幾種抗生素比較敏感，所以該菌株的實驗開發等是相對安全的，不會引起不可控制的感染等，這也利于該菌株的纖溶酶發酵應用。表1菌株MY0504對常用抗生素的敏感程度注：“+”為敏感，“++”為非常敏感實施例2、菌株MY0504的鑒定一、形態特征菌株MY0504在海水LB培養基中26℃培養48h，菌落奶白色，干燥，孢子橢圓形，圓滑。二、生理生化性質該菌株的可培養條件為溫度15-40℃，pH6-14，鹽(NaCl)濃度1％-10％。其它生理生化指標見表2，實驗方法均為常規微生物生理、生化特征實驗。表2：纖溶酶菌株的生理生化實驗結果三、16SrRNA16SrRNA序列的測定由寶生物工程(大連)有限公司完成。將拼接好的序列于CNBI網站進行Blast進行相似性比較，菌株MY0504與鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株高度相關,認定該菌株屬于鏈霉菌屬，該菌株與S本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種海洋放線菌MY0504，該菌于2015年3月25日于中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏，其保藏編號為CGMCC?No.10664。

【技術特征摘要】
1.一種海洋放線菌MY0504，該菌于2015年3月25日于中國微生
物菌株保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏，其保藏編號為
CGMCCNo.10664。
2.如權利要求1所述的海洋放線菌MY0504，其特征在于：其對青
霉素、四環素、環丙沙星、慶大霉素或桿菌肽抗生素敏感。
3.如權利要求1所述的海洋放線菌MY0504在制備纖溶酶中的用途。
4.一種纖溶酶的制備方法，其特征在于：發酵菌接入LB海...

【專利技術屬性】
技術研發人員：董超，史延茂，米陽，侯正欣，
申請(專利權)人：河北省科學院生物研究所，
類型：發明
國別省市：河北;13