一種提高內生真菌發酵產物中紫杉醇產量的方法技術

本發明專利技術公開了一種提高內生真菌發酵產物中紫杉醇產量的方法，包括：將產紫杉醇內生真菌種子液接入含有曼地亞紅豆杉和蜘蛛香的內生真菌固態發酵培養基中培養，然后置于交變磁場環境中再培養，得內生真菌固態發酵產物；再將產紫杉醇內生真菌種子液接入含有內生真菌固態發酵產物的液體發酵培養基中培養，得到內生真菌發酵終產物。該方法原料來源天然，對環境無污染，周期短，產率高，適于工業化生產，與普通內生真菌發酵產物相比，本發明專利技術方法內生真菌發酵產物中紫杉醇的產量明顯提高。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物發酵領域，具體涉及一種提高內生真菌發酵產物中紫杉醇產量的 方法。
技術介紹
紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol)是一種二砲類衍生物，是具有獨特抗癌機制 的天然產物，分子式為C 47H51NO14，最初從紅豆杉植物中分離得到。經臨床驗證，具有良好的 抗腫瘤作用，特別是對癌癥發病率較高的卵巢癌、子宮癌和乳腺癌等有特效。紫杉醇是近年 來國際市場上最熱門的抗癌藥物之一。隨著地球人口癌發率的增長，對紫杉醇的需求量明 顯增大。目前臨床和科研所需的紫杉醇主要是從紅豆杉中直接提取。由于紫杉醇在植物體 中含量極低，生產Ikg紫杉醇需要2500棵左右成年紅豆杉樹木的原料，也因此造成了對紅 豆杉的大量砍伐，致使其天然資源趨于枯竭，造成了生物多樣性和生態環境的極大破壞。 能合成紫杉醇的紅豆杉內生真菌的發現，是紫杉醇資源研究的重要進展。自從 Stierle等證明短葉紅豆杉的內生真菌可以產生抗癌藥物紫杉醇，對植物內生真菌的研究 更加引人注目。我國學者也發現了多種產紫杉醇的內生真菌。 植物內生菌是一種分布廣、種類多、生物學功能多樣的微生物資源庫。在與宿主植 物長期共進化過程中，內生菌可產生一系列具有抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制等作用的生物活 性。由于內生真菌生長迅速，易于進行大規模培養，培養所需的原料可以是來源廣泛、價格 低廉的農林副產物，因而利用內生真菌生物制備紫杉醇，被認為是破解紫杉醇來源的最有 效的解決方法。利用內生真菌生物制備紫杉醇如：中國專利ZL200810152499. 2公開了一種 利用雙液相發酵提高真菌產紫杉醇的方法，其包括在培養基中培養產紫杉醇真菌擬盤多毛 孢（Pestalotiopsis microspora)NK17,當菌體生長達到平臺期，加入有機溶劑繼續培養， 以使在所述菌株細胞內和所述培養基中更多地產生和聚集紫杉醇，以及從所述細胞內和培 養基中回收并提純紫杉醇。該方法紫杉醇產率可達551. 72 μ g/L。如能開發新的提高紫杉 醇產量的內生真菌發酵方法，將有望為紫杉醇的制備提供新的途徑。
技術實現思路
本專利技術提供了，該方法周期短、 產率高，適于工業化生產。 本專利技術發現，通過本專利技術特定的內生真菌發酵及特定的工藝，同時在培養基中添 加具有協同增產效果的曼地亞紅豆杉和蜘蛛香，能夠有效地將其營養成分和有效成分進行 生物降解和轉化，使各原料資源得到充分的利用，有助于提高最終產品中紫杉醇的含量。 本專利技術采用的技術方案是： -種提高內生真菌發酵產物中紫杉醇產量的方法，包括步驟： (1)取活化后的產紫杉醇內生真菌菌種接種到液體MRS培養基中培養4h-6h，離心 收集第一菌體；將第一菌體懸浮在含膽鹽的液體MRS培養基中于20°C -30°C孵育3h-40h， 離心收集第二菌體；將第二菌體經PBS緩沖液清洗干凈后重新懸浮于液體MRS培養基中，震 蕩搖勻，在20°C -30°C培養2天-10天，得到產紫杉醇內生真菌種子液； (2)將步驟（1)的產紫杉醇內生真菌種子液接入內生真菌固態發酵培養基中，在 16°C -30°C培養3天-30天，然后置于交變磁場環境中再培養5天-20天，培養產物經真空 冷凍干燥、粉碎后得內生真菌固態發酵產物；所述內生真菌固態發酵培養基中含有曼地亞 紅豆杉和蜘蛛香； (3)將步驟（1)的產紫杉醇內生真菌種子液接入液體發酵培養基中，調pH值為 3-7,在15°C -25°C培養5天-25天，離心，得到內生真菌發酵終產物；所述液體發酵培養基 中含有內生真菌固態發酵產物。 本專利技術進行固態發酵時，直接采用經含膽鹽的液體MRS培養基孵育處理的產紫杉 醇內生真菌種子液，同時在培養基中添加具有協同增產效果的蜘蛛香，能夠有效地將紅豆 杉中的營養成分和有效成分進行生物降解和轉化，有助于提高最終產品中紫杉醇的含量。 步驟（3)中，再次采用經含膽鹽的液體MRS培養基孵育處理的產紫杉醇內生真菌種子液對 含有內生真菌固態發酵產物的液體發酵培養基進行深層次發酵，使原料資源得到充分的利 用，進一步提高了最終產品中紫杉醇的含量。 為了達到更好的效果，優選： 步驟⑴中，所述含膽鹽的液體MRS培養基中膽鹽的質量百分含量為 0· 1% -0· 5%〇 所述第一菌體與用于懸浮第一菌體的含膽鹽的液體MRS培養基的體積比為 1:1-3,第二菌體與用于懸浮第二菌體的液體MRS培養基的體積比為1:1-3。 步驟（2)中，所述曼地亞紅豆杉可采用曼地亞紅豆杉的枝葉；所述蜘蛛香可采用 蜘蛛香枝葉。 所述內生真菌固態發酵培養基每IL中含有2. Og-8. Og曼地亞紅豆杉和0. 5g-2. 5g 蜘蛛香。所述內生真菌固態發酵培養基由曼地亞紅豆杉、蜘蛛香和發酵基礎培養基組成，所 述發酵基礎培養基采用本領域常規的發酵基礎培養基，可采用市售產品，也可采用現有配 制方法配制。 所述內生真菌固態發酵培養基的制備方法，包括：將新鮮曼地亞紅豆杉、蜘蛛香在 自來水下沖洗干凈，晾干，切碎；再將2. Og-8. Og曼地亞紅豆杉和0. 5g-2. 5g蜘蛛香用發酵 基礎培養基定容至1L，混合均勻，pH值自然，得到內生真菌固態發酵培養基。 所述產紫杉醇內生真菌種子液的接入量為內生真菌固態發酵培養基體積的 5% -25%〇 目前產紫杉醇內生真菌發酵技術普遍存在發酵周期長、菌絲生長萌發慢、特征次 生代謝產物含量低等問題。本專利技術發現將交變磁場處理技術應用于固態發酵中，通過特定 培養時期的適當處理等外界因素有效刺激，提高真菌菌絲在曼地亞紅豆杉和蜘蛛香培養基 料上的生長代謝，縮短發酵時間，有效促進次生代謝產物的生成。所述交變磁場環境中磁場 強度為0. 2mT-6mT，磁場頻率為3HZ-40HZ。 步驟（3)中，所述液體發酵培養基每IL中含有0. 2g_lg內生真菌固態發酵產物。 所述液體發酵培養基由內生真菌固態發酵產物和發酵基礎培養基組成，所述的發酵基礎培 養基采用本領域常規的發酵基礎培養基，可采用市售產品，也可采用現有配制方法配制。 所述液體發酵培養基的制備方法，包括：將0. 2g_lg內生真菌固態發酵產物用發 酵基礎培養基定容至1L，混合均勻，pH值自然，得到液體發酵培養基。 -般發酵基礎培養基由以下質量百分比的組分組成：葡萄糖1% -3%、K2HPO4 0· 1% -0· 2%、MgS04 0· 05% -0· 1%和余量的水。 所述產紫杉醇內生真菌種子液的接入量為液體發酵培養基體積的3% -20%。 所述產紫杉醇內生真菌菌種可采用現有任意一種產紫杉醇內生真菌菌種，可采用 市售產品，例如：美麗鐮刀菌（Fusarium mairei)菌種，購于北京北納創聯生物技術研究 院。 所述液體MRS培養基采用本領域常規的液體MRS培養基，可采用市售產品，也可采 用現有配制方法配制。一般液體MRS培養基的組成為：蛋白胨10. 0g、牛肉浸膏10. 0g、酵 母浸膏5. 0g、葡萄糖20. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸氫二銨2. 0g、吐溫-801. 0ml、磷酸氫二鉀 2. 0g、硫酸鎂0. 2g、硫酸錳0. 05g和蒸餾水1. 0升。 所述PBS緩沖液即磷酸緩沖鹽溶液，采用本領域常規的PBS緩沖液，可采用市售 產品，也可采用現有配制方法配制本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種提高內生真菌發酵產物中紫杉醇產量的方法，其特征在于，包括步驟：(1)取活化后的產紫杉醇內生真菌菌種接種到液體MRS培養基中培養4h?6h，離心收集第一菌體；將第一菌體懸浮在含膽鹽的液體MRS培養基中于20℃?30℃孵育3h?40h，離心收集第二菌體；將第二菌體經PBS緩沖液清洗干凈后重新懸浮于液體MRS培養基中，震蕩搖勻，在20℃?30℃培養2天?10天，得到產紫杉醇內生真菌種子液；(2)將步驟(1)的產紫杉醇內生真菌種子液接入內生真菌固態發酵培養基中，在16℃?30℃培養3天?30天，然后置于交變磁場環境中再培養5天?20天，培養產物經真空冷凍干燥、粉碎后得內生真菌固態發酵產物；所述內生真菌固態發酵培養基中含有曼地亞紅豆杉和蜘蛛香；(3)將步驟(1)的產紫杉醇內生真菌種子液接入液體發酵培養基中，調pH值為3?7，在15℃?25℃培養5天?25天，離心，得到內生真菌發酵終產物；所述液體發酵培養基中含有內生真菌固態發酵產物。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：程俊文，賀亮，魏海龍，胡傳久，方茹，李海波，
申請(專利權)人：浙江省林業科學研究院，
類型：發明
國別省市：浙江;33