同時增強滸苔多糖抗氧化和抗菌活性的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種同時增強滸苔多糖抗氧化和抗菌活性的方法，包括以下步驟：利用過氧化氫和維生素C對滸苔粗多糖進(jìn)行降解，得到降解滸苔多糖；以氯乙酸為羧甲基化試劑，與降解滸苔多糖反應(yīng)，從而制備羧甲基化滸苔多糖(CDEP)。本發(fā)明專利技術(shù)的CDEP具有較低的分子量(20-120kDa)，其羧甲基取代度(DS)為0.3～1.0。本發(fā)明專利技術(shù)的CDEP具有較好的體外抗氧化活性和抗菌作用。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
同時增強滸苔多糖抗氧化和抗菌活性的方法
本專利技術(shù)屬于化學(xué)化工
，涉及一種通過對降解滸苔多糖進(jìn)行化學(xué)修飾從而增強其生物活性的方法。
技術(shù)介紹
滸苔是我國東南沿海的一種大型經(jīng)濟性綠藻，資源豐富，本身可以食用，并含有多種活性物質(zhì)，如滸苔多糖，脂類色素，酚類等。據(jù)文獻(xiàn)報道，滸苔多糖具有提高哺乳動物免疫力、降血脂、消炎抗菌以及抗氧化等生理功能。因此將滸苔開發(fā)成功能食品有很好的前景。滸苔水提多糖主要為水溶性的硫酸多糖，分子量大，生物活性相對較低。如果將其降解成分子量相對較小的產(chǎn)物，則由于游離出更多的活性基團，則可能會使其生物活性得到提高。另外，通過化學(xué)修飾在多糖分子中引入一些功能基也能使多糖的生物活性得到提高。已有文獻(xiàn)報道了滸苔多糖的硫酸化、磷酸化和乙?；揎?，經(jīng)修飾之后的滸苔多糖的抗氧化活性顯著提高；也有報道滸苔多糖經(jīng)硒化后提高抗菌活性，但尚未有同時提高滸苔多糖抗菌和抗氧化活性的方法報道。目前現(xiàn)有的滸苔粗多糖的降解法包括：氧化降解法，酸降解以及酶解法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問題是提供一種能同時提高滸苔多糖的抗氧化、抗菌活性的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種同時增強滸苔多糖抗氧化和抗菌活性的方法，包括以下步驟：1)、降解：將滸苔粗多糖(EP)溶于蒸餾水配成濃度為2～20mg/mL(較佳為10mg/mL)的滸苔粗多糖溶液，升溫至30～50℃后分別加入過氧化氫和維生素C，直至過氧化氫和維生素C的終濃度均為6～12mmol/L(較佳為9mmol/L)；然后保溫攪拌反應(yīng)2～4h，從而實現(xiàn)對滸苔粗多糖進(jìn)行降解；2)、將步驟1)所得的反應(yīng)液濃縮至為原體積的1/2～1/4(約1/3)，得濃縮液；用4倍濃縮液體積的體積濃度為95％乙醇沉淀，于3～5℃靜置10～12h(例如4℃過夜)，離心(8000rpm,20min)，取沉淀用水進(jìn)行復(fù)溶，所述沉淀與水的用量比為18～22mg/ml(例如為20mg/ml)，然后用截留分子量為3500Da的透析袋透析46～50h(例如48h)，將所得的透析液冷凍干燥，得到降解滸苔多糖(DEP，為粉末狀)；備注說明：DEP不具備抗菌活性；3)、羧甲基化：將0.3g降解滸苔多糖(DEP，為粉末狀)溶于12.5ml的二甲基亞砜(DMSO)中，室溫下攪拌1.5～2.5h；然后加入質(zhì)量濃度20％氫氧化鈉溶液5ml，于35～45℃攪拌2.5～3.5h，得反應(yīng)液Ⅰ；將氯乙酸溶于12.5ml的二甲基亞砜(DMSO)和質(zhì)量濃度20％氫氧化鈉溶液5ml中，配制得濃度為2～6mol/L(較佳為3～4mol/L)的氯乙酸溶液，作為反應(yīng)液Ⅱ；將反應(yīng)液Ⅱ與上述反應(yīng)液Ⅰ等體積混合(注：從而使混合得到的反應(yīng)液中氯乙酸終濃度為1～3mol/L，較佳為1.5～2mol/L)，然后于45～65℃反應(yīng)2～6小時(較佳為50～55℃反應(yīng)3～4小時)；4)、將步驟3)得到的反應(yīng)液冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至中性(可用0.5mol/L的HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)，中性，即，pH＝7.0)，然后加水稀釋(水與步驟3所得反應(yīng)液的體積比約為1：1)，再用3500Da的透析袋透析48h，將透析液濃縮至原體積的1/2～1/4(例如為1/3)、冷凍干燥，得到羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP，為白色粉末狀)。所述羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)為降解滸苔多糖的羧甲基化衍生物(CDEP)。作為本專利技術(shù)的同時增強滸苔多糖抗氧化和抗菌活性的方法的改進(jìn)：羧甲基化降解滸苔多糖(降解滸苔多糖的羧甲基化衍生物)，具有較低的分子量(20-120kDa)，其羧甲基取代度(DS)為0.3～1.0。作為本專利技術(shù)的同時增強滸苔多糖抗氧化和抗菌活性的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟2)、4)中的冷凍干燥是：于-45～-55℃冷凍干燥22～26小時(例如為于-50℃冷凍干燥24小時)。在本專利技術(shù)中，室溫一般是指10～30℃。本專利技術(shù)涉及將降解的滸苔多糖進(jìn)行羧甲基化修飾的方法。本專利技術(shù)首先將滸苔粗多糖(EP)用過氧化氫-維生素C聯(lián)合法進(jìn)行降解，再以氯乙酸為羧甲基化試劑，與降解滸苔多糖反應(yīng)制備羧甲基化滸苔多糖(CDEP)。以羧甲基取代度(DS)為評價指標(biāo)，研究了反應(yīng)時間(2～6h)、反應(yīng)溫度(30～65℃)和氯乙酸濃度(1～3mol/L)對其的影響。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Bohnken中心組合試驗和響應(yīng)面法(RSM)對降解的滸苔多糖的羧甲基反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。將在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下的到的CDEP進(jìn)行抗氧化活性及抗菌活性評價。備注說明：本專利技術(shù)滸苔粗多糖按文獻(xiàn)報道方法制備(JieXu,Li-LiXu,Qin-WeiZhou,Shu-XianHao,TaoZhou,Hu-JunXie.EnhancedinvitroantioxidantactivityofpolysaccharidesfromEnteromorphaProliferabyenzymaticdegradation.JournalofFoodBiochemistry.doi:10.1111/jfbc.12218)。滸苔粗多糖(EP)中總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、硫酸根的含量分別為49.2％、15.7％、0.8％和12.3％；用高效凝膠滲透層析法測得其多糖分子量為1480kDa。本專利技術(shù)具有如下技術(shù)效果：1.與未降解的滸苔粗糖(EP)和降解滸苔多糖(DEP)相比，本專利技術(shù)得到的羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)的體外抗氧化活性顯著提高。2.未降解的滸苔粗糖(EP)和降解滸苔多糖(DEP)在測試濃度范圍內(nèi)沒有顯示出抗菌活性，本專利技術(shù)得到的CDEP則對幾種革蘭氏陽性菌和陰性菌都顯示出明顯的抑制作用。附圖說明下面結(jié)合附圖對本專利技術(shù)的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是由本專利技術(shù)實施例2-1得到的羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)與降解滸苔多糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果。圖2是由本專利技術(shù)實施例2-1得到的羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)與降解滸苔多糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的超氧陰離子自由基清除能力的測定結(jié)果。圖3是由本專利技術(shù)實施例2-1得到的羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)與降解滸苔多糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的羥基自由基清除能力的測定結(jié)果。圖4是本專利技術(shù)實施例2-1得到的羧甲基化降解滸苔多糖(CDEP)與降解滸苔多糖(DEP)以及未降解多糖(EP)的總抗氧化能力的測定結(jié)果。具體實施方式實施例1-1、滸苔粗多糖(EP)的降解：將滸苔粗多糖(EP)溶于蒸餾水配成濃度為10mg/mL的滸苔粗多糖溶液，升溫至30℃后分別加入過氧化氫和維生素C，直至過氧化氫和維生素C的終濃度均為9mmol/L；然后保溫攪拌反應(yīng)2h，從而實現(xiàn)對滸苔粗多糖進(jìn)行降解。將所得的反應(yīng)液濃縮(于60～70℃進(jìn)行減壓濃縮)至為原體積的約1/3，得濃縮液；用4倍濃縮液體積的體積濃度為95％乙醇沉淀，4℃過夜(約12小時)，離心(8000rpm,20min)，取沉淀用水進(jìn)行復(fù)溶(所述沉淀與水的用量比約為20mg/ml)，用截留分子量為3500Da的透析袋透析48h，將所得的透析液冷凍干燥(于-50℃冷凍干燥24小時)，得到粉末狀的降解滸苔多糖(DEP)。DEP中總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、硫酸根的含量分別為51.9％、15.5％、0.65％和13.9本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
同時增強滸苔多糖抗氧化和抗菌活性的方法，其特征是包括以下步驟：1)、降解：將滸苔粗多糖溶于蒸餾水配成濃度為2～20mg/mL的滸苔粗多糖溶液，升溫至30～50℃后分別加入過氧化氫和維生素C，直至過氧化氫和維生素C的終濃度均為6～12mmol/L；然后保溫攪拌反應(yīng)2～4h，從而實現(xiàn)對滸苔粗多糖進(jìn)行降解；2)、將步驟1)所得的反應(yīng)液濃縮至為原體積的1/2～1/4，得濃縮液；用4倍濃縮液體積的體積濃度為95％乙醇沉淀，于3～5℃靜置10～12h，離心，取沉淀用水進(jìn)行復(fù)溶，所述沉淀與水的用量比為18～22mg/ml，然后用截留分子量為3500Da的透析袋透析46～50h，將所得的透析液冷凍干燥，得到降解滸苔多糖；3)、羧甲基化：將0.3g降解滸苔多糖溶于12.5ml的二甲基亞砜中，室溫下攪拌1.5～2.5h；然后加入質(zhì)量濃度20％氫氧化鈉溶液5ml，于35～45℃攪拌2.5～3.5h，得反應(yīng)液Ⅰ；將氯乙酸溶于12.5ml的二甲基亞砜和質(zhì)量濃度20％氫氧化鈉溶液5ml中，配制得濃度為2～6mol/L的氯乙酸溶液，作為反應(yīng)液Ⅱ；將反應(yīng)液Ⅱ與上述反應(yīng)液Ⅰ等體積混合，然后于45～65℃反應(yīng)2～6小時；4)、將步驟3)得到的反應(yīng)液冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至中性，然后加水稀釋，再用3500Da的透析袋透析48h，將透析液濃縮至原體積的1/2～1/4，冷凍干燥，得到羧甲基化降解滸苔多糖。...

【技術(shù)特征摘要】
1.同時增強滸苔多糖抗氧化和抗菌活性的方法，其特征是包括以下步驟：1)、降解：將滸苔粗多糖溶于蒸餾水配成濃度為2～20mg/mL的滸苔粗多糖溶液，升溫至30～50℃后分別加入過氧化氫和維生素C，直至過氧化氫和維生素C的終濃度均為6～12mmol/L；然后保溫攪拌反應(yīng)2～4h，從而實現(xiàn)對滸苔粗多糖進(jìn)行降解；2)、將步驟1)所得的反應(yīng)液濃縮至為原體積的1/2～1/4，得濃縮液；用4倍濃縮液體積的體積濃度為95％乙醇沉淀，于3～5℃靜置10～12h，離心，取沉淀用水進(jìn)行復(fù)溶，所述沉淀與水的用量比為18～22mg/ml，然后用截留分子量為3500Da的透析袋透析46～50h，將所得的透析液冷凍干燥，得到降解滸苔多糖；3)、羧甲基化：將0.3g降解滸苔多糖溶于12.5ml的二甲基亞砜中，室溫下攪拌1.5～2.5h；然后加入質(zhì)量濃度20％氫氧化鈉溶液5...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周濤，許杰，
申請(專利權(quán))人：浙江工商大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33