本發(fā)明專利技術(shù)涉及轉(zhuǎn)基因玉米，具體公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米成熟胚莖尖轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明專利技術(shù)利用玉米莖尖作為受體不受基因型的限制，還開發(fā)了一套嚴(yán)格適用于玉米莖尖作為轉(zhuǎn)化受體的培養(yǎng)基體系，實(shí)現(xiàn)玉米的高效遺傳轉(zhuǎn)化。本發(fā)明專利技術(shù)所述方法縮短了玉米的轉(zhuǎn)化周期，以莖尖作為受體不受基因型的限制，還可以免除轉(zhuǎn)基因過程中的植株再生等環(huán)節(jié)。突破了轉(zhuǎn)化外植體的限制，提高了玉米的轉(zhuǎn)化效率。該方法操作簡(jiǎn)便，簡(jiǎn)單易行，轉(zhuǎn)化周期短，轉(zhuǎn)化效率高，結(jié)果可靠，能夠快速獲取轉(zhuǎn)基因玉米植株。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及轉(zhuǎn)基因玉米，具體地說，涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米成熟胚莖尖轉(zhuǎn)化 方法。
技術(shù)介紹
玉米在我國的栽培歷史大約有470多年。目前我國播種面積在3億畝左右，僅次 于稻、麥，在糧食作物中居第三位，在世界上僅次于美國。玉米主要用作食量、飼料、能源、 營養(yǎng)品以及醫(yī)藥工業(yè)的原料，其工業(yè)價(jià)值廣泛用于造紙、食品、紡織、醫(yī)藥等行業(yè)，具有產(chǎn)量 高、耐儲(chǔ)存、再生產(chǎn)價(jià)值高的特點(diǎn)。 截止至2014年，轉(zhuǎn)基因作物種植面積從1996年的170萬公頃增長(zhǎng)到2014年的 1. 815億公頃，其中耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米種植面積在800萬公頃左右，抗蟲轉(zhuǎn)基因種植面積 為600萬公頃（中國生物技術(shù)信息網(wǎng)）。這一增長(zhǎng)使得轉(zhuǎn)基因技術(shù)以可觀的利潤成為現(xiàn)代 農(nóng)業(yè)史上應(yīng)用最迅速的作物技術(shù)。轉(zhuǎn)基因作物不僅對(duì)糧食安全做出了巨大貢獻(xiàn)，在可持續(xù) 性和氣候變化等方面也有諸多貢獻(xiàn)。 雖然玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用取得了巨大進(jìn)展，但是仍然存在著很多問題。重要一 點(diǎn)在于組織培養(yǎng)技術(shù)還不是很成熟，很大的抑制轉(zhuǎn)化的成功，畢竟現(xiàn)在多數(shù)轉(zhuǎn)化方法都是 以植物組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)。自1975年以來已經(jīng)從包括玉米幼胚、未成熟花序、小抱子、胚葉、 雌雄幼穗等多種外植體誘導(dǎo)出愈傷組織。但是由于玉米品系眾多、遺傳背景復(fù)雜、離體培養(yǎng) 影響因子多且相互作用等因素的影響，仍存在玉米組織培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)率低、質(zhì)量不穩(wěn)定、實(shí) 驗(yàn)重復(fù)性差、再生植株成活率低等多重困難。現(xiàn)如今玉米的轉(zhuǎn)化大多數(shù)采用轉(zhuǎn)化幼胚的方 法，而幼胚長(zhǎng)度又和基因型及采樣季節(jié)有很大關(guān)系。一般早熟品種授粉后幼胚生長(zhǎng)較快。 晚熟品種生長(zhǎng)較慢；夏季高溫季節(jié)授粉后幼胚生長(zhǎng)較快，秋季溫度較低時(shí)幼胚生長(zhǎng)較慢。因 此，采樣時(shí)間要根據(jù)基因型、生長(zhǎng)季節(jié)和幼胚大小來決定。基因型仍是幼胚培養(yǎng)的主要限制 因素。 如公開號(hào)為CN1263949的中國專利申請(qǐng)，公開了一種建立玉米轉(zhuǎn)基因受體體系的 方法及應(yīng)用。將玉米莖尖接種在附加不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)莖尖培養(yǎng)物直接 產(chǎn)生叢生芽或叢生芽組織塊。取繼代培養(yǎng)后處于旺盛生長(zhǎng)期的叢生芽和叢生芽組織塊為受 體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法等將外源基因轉(zhuǎn)入培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)過恢復(fù)、篩選等步驟 獲得轉(zhuǎn)基因植株。但是，利用莖尖分化的叢生芽作為外植體仍需要長(zhǎng)期的誘導(dǎo)、繼代、分化 等培養(yǎng)過程，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)的缺點(diǎn)制約著玉米遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展。 再如公開號(hào)為CN102304544A的中國專利申請(qǐng)，公開了一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大 麥莖尖轉(zhuǎn)化方法，其步驟:A.大麥莖尖培養(yǎng)及載體構(gòu)建：1)選取大麥穎果，去除稃片，剝?nèi)?成熟胚，盾片向下放置在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)；2)從中間載體pMBL-3及和綠色熒光蛋白基因 GFP用酶切和PCR方法獲得玉米泛素啟動(dòng)子及相關(guān)序列；B、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)大麥莖尖遺傳 轉(zhuǎn)化，步驟：1)大麥莖尖的獲取；2)莖尖的浸染；3)莖尖和農(nóng)桿菌LBA4401共培養(yǎng)培養(yǎng)基： 取出經(jīng)農(nóng)桿菌浸染的莖尖，在無菌濾紙上吸干表層菌液；4)莖尖的恢復(fù)培養(yǎng)基；5)莖尖的 篩選培養(yǎng)基；6)再生植株的春化和栽培，得到候選的轉(zhuǎn)化植株。方法易行，操作簡(jiǎn)便，周期 短、效率高，程序簡(jiǎn)單，操作方便，結(jié)果可靠。但是，大麥與玉米雖都為單子葉植物，但大麥與 玉米作為兩種不同的作物也決定了在轉(zhuǎn)化上的差異，而目前未見適用于玉米的技術(shù)方案。 目前，玉米遺傳轉(zhuǎn)化方法主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，其受體主要是幼胚 和胚性愈傷組織，而愈傷組織形成的再生植株無性系變異大、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)也制約著玉米 遺傳轉(zhuǎn)化研究的發(fā)展。 因此，選擇合適的外植體作為玉米遺傳轉(zhuǎn)化的受體，高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是轉(zhuǎn)基 因研究的重要環(huán)節(jié)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本專利技術(shù)的目的是提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米成 熟胚莖尖轉(zhuǎn)化方法。 為了實(shí)現(xiàn)本專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下： 本專利技術(shù)首先提供，包括如下步驟： A、玉米莖尖培養(yǎng)及載體構(gòu)建： 1)挑選飽滿無損傷的種子，進(jìn)行消毒處理后，取成熟胚放于萌發(fā)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng) 箱中經(jīng)過低溫處理，再置于23-28Γ暗培養(yǎng)進(jìn)行萌發(fā)； 2)構(gòu)建攜帶目的基因的植物表達(dá)載體，將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿 菌； B、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米成熟胚莖尖遺傳轉(zhuǎn)化： 1)玉米成熟胚莖尖的獲取： 待胚芽長(zhǎng)到3-5cm時(shí)，在芽節(jié)點(diǎn)上方l-2mm的位置橫切第一刀，將胚芽結(jié)上部切掉 丟棄，得到莖尖，在莖尖切口處的中央部位向下縱切第二刀，切口稍越過結(jié)的下線約1_，用 刺針刺傷橫切面生長(zhǎng)點(diǎn)上端，在高滲培養(yǎng)基中放置lh以上； 2)莖尖的侵染： 從步驟1)得到的玉米成熟胚莖尖，加入用根癌農(nóng)桿菌浸染培養(yǎng)基懸浮的根癌農(nóng) 桿菌LBA4401菌液，浸染莖尖4-6min; 3)莖尖和根癌農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)： 取出經(jīng)根癌農(nóng)桿菌浸染的莖尖，在無菌濾紙上吸干表層菌液，于共培養(yǎng)固體培養(yǎng) 基上在24-28 °C共培養(yǎng)3d; 4)莖尖的恢復(fù)培養(yǎng)： 將步驟3)中的莖尖轉(zhuǎn)至恢復(fù)培養(yǎng)基，于22-24Γ下培養(yǎng)至從生長(zhǎng)點(diǎn)部位萌生出新 的幼葉； 5)轉(zhuǎn)化苗的轉(zhuǎn)苗及栽苗： 將長(zhǎng)出新葉的幼苗從恢復(fù)培養(yǎng)基中取出，洗掉多余的恢復(fù)培養(yǎng)基，栽入花盆中，在 人工氣候箱中光照培養(yǎng)，等葉片伸展后移栽到溫室大棚中； 6)對(duì)伸展出新生葉的幼苗進(jìn)行抗性篩選： 幼苗長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)，用除草劑處理新生葉片，除草劑的噴施根據(jù)苗情來判斷，篩 選抗性幼苗，將正常生長(zhǎng)的玉米幼苗連根挖出移栽入大田；所述萌發(fā)培養(yǎng)基為：33000mg/L NH4N03,38 0 00mg/L KN03,88 00mg/L CaCl2 · 2H20， 7400mg/L MgS04.7H20,3400mg/L KH2P04,4400mg/L MnS04.4H20,800mg/L H2B03，1600mg/ L KI，1600mg/L ZnS04 · 7H20,4. 88 5mg/L氯化膽堿，2. 445mg/L核黃素，5. 008mg/L生物素， 2. 425mg/L葉酸，9. 97mg/L煙酸，23. 611mg/L維生素BI，5. Omg/L D-泛酸鈣，9. 97mg/L鹽酸 吡哆辛，〇·〇〇675mg/L維生素B12, 2. 47mg/L對(duì)氨基甲苯，7. 46mg/L Na2EDTA.2H20, 5. 56mg/L FeS04. 7H20, 500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，30000mg/L鹿糖，5000mg/L葡萄糖， 100mg/L肌醇，8000mg/L瓊脂粉pH 5. 8 ;所述高滲培養(yǎng)基：56600mg/L KN03,9 2 60mg/L NH4S04,3 7 00mg/L MgS04 7H20， 8000mg/LKH2P04,33200mg/LCaCl. 2H20, lOOmg/L MnS04 4H20,20mg/L ZnS04.7H20,0· 25mg/L CoCl2 6H20,0· 25mg/L CuS04 5H20, 2. 5mg/L NaMo04 2H20,4. 885mg/L氯化膽堿，2. 445mg/L核 黃素，5. 008mg/L生物素，2. 425mg/L葉酸，9. 97mg/L煙酸，23. 611mg/L維生素BI，5. Omg/L D-泛酸鈣，9. 97mg/L鹽酸吡哆辛，0· 00675mg/L維生素B12, 2. 47m本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米成熟胚莖尖轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括如下步驟：A、玉米莖尖培養(yǎng)及載體構(gòu)建：1)挑選飽滿無損傷的種子，進(jìn)行消毒處理后，取成熟胚放于萌發(fā)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中經(jīng)過低溫處理，再置于23?28℃暗培養(yǎng)進(jìn)行萌發(fā)；2)構(gòu)建攜帶目的基因的植物表達(dá)載體，將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；B、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米成熟胚莖尖遺傳轉(zhuǎn)化：1)玉米成熟胚莖尖的獲取：待胚芽長(zhǎng)到3?5cm時(shí)，在芽節(jié)點(diǎn)上方1?2mm的位置橫切第一刀，將胚芽結(jié)上部切掉丟棄，得到莖尖，在莖尖切口處的中央部位向下縱切第二刀，切口稍越過結(jié)的下線約1mm，用刺針刺傷橫切面生長(zhǎng)點(diǎn)上端，在高滲培養(yǎng)基中放置1h以上；2)莖尖的侵染：從步驟1)得到的玉米成熟胚莖尖，加入用根癌農(nóng)桿菌浸染培養(yǎng)基懸浮的根癌農(nóng)桿菌LBA4401菌液，浸染莖尖4?6min；3)莖尖和根癌農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)：取出經(jīng)根癌農(nóng)桿菌浸染的莖尖，在無菌濾紙上吸干表層菌液，于共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上在24?28℃共培養(yǎng)3d；4)莖尖的恢復(fù)培養(yǎng)：將步驟3)中的莖尖轉(zhuǎn)至恢復(fù)培養(yǎng)基，于22?24℃下培養(yǎng)至從生長(zhǎng)點(diǎn)部位萌生出新的幼葉；5)轉(zhuǎn)化苗的轉(zhuǎn)苗及栽苗：將長(zhǎng)出新葉的幼苗從恢復(fù)培養(yǎng)基中取出，洗掉多余的恢復(fù)培養(yǎng)基，栽入花盆中，在人工氣候箱中光照培養(yǎng)，等葉片伸展后移栽到溫室大棚中；6)對(duì)伸展出新生葉的幼苗進(jìn)行抗性篩選：幼苗長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)，用除草劑處理新生葉片，除草劑的噴施根據(jù)苗情來判斷，篩選抗性幼苗，將正常生長(zhǎng)的玉米幼苗連根挖出移栽入大田；常規(guī)方法在轉(zhuǎn)苗前驚醒篩選培養(yǎng)，而成熟胚莖尖轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化的生長(zhǎng)點(diǎn)，所以幼苗長(zhǎng)到兩葉一心時(shí)，才能用除草劑處理新生葉片。所述萌發(fā)培養(yǎng)基為：33000mg/L?NH4NO3，38000mg/L?KNO3，8800mg/L?CaCl2·2H20，7400mg/L?MgSO4·7H20，3400mg/L?KH2PO4，4400mg/L?MnS04·4H20，800mg/L?H2BO3，1600mg/L?KI，1600mg/L?ZnSO4·7H20，4.885mg/L氯化膽堿，2.445mg/L核黃素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L葉酸，9.97mg/L煙酸，23.611mg/L維生素BI，5.0mg/L?D?泛酸鈣，9.97mg/L鹽酸吡哆辛，0.00675mg/L維生素B12，2.47mg/L對(duì)氨基甲苯，7.46mg/L?Na2EDTA.2H2O，5.56mg/L?FeSO4.7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL?脯氨酸，30000mg/L蔗糖，5000mg/L葡萄糖，100mg/L肌醇，8000mg/L瓊脂粉pH?5.8；所述高滲培養(yǎng)基：56600mg/L?KNO3，9260mg/L?NH4SO4，3700mg/L?MgSO4·7H2O，8000mg/LKH2PO4，33200mg/LCaCl·2H2O，100mg/L?MnSO4·4H2O，20mg/L?ZnSO4·7H2O，0·25mg/L?CoCl2·6H2O，0.25mg/L?CuSO4·5H2O，2.5mg/L?NaMoO4·2H2O，4.885mg/L氯化膽堿，2.445mg/L核黃素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L葉酸，9.97mg/L煙酸，23.611mg/L維生素BI，5.0mg/L?D?泛酸鈣，9.97mg/L鹽酸吡哆辛，0.00675mg/L維生素B12，2.47mg/L對(duì)氨基甲苯，7.46mg/L?Na2EDTA·2H2O，5.56mg/L?FeSO4·7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/L?L?脯氨酸，20000mg/L蔗糖，10000mg/L葡萄糖pH?5.8；所述浸染培養(yǎng)基為：56600mg/L?KNO3，9260mg/L?NH4SO4，3700mg/LMgSO4·7H2O，8000mg/LKH2PO4，33200mg/LCaCl·2H2O，100mg/LMnSO4.4H2O，20mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LCoCl2·6H2O，0.25mg/LCuSO4·5H2O，2.5mg/LNaMoO4·2H2O，4.885mg/L氯化膽堿，2.445mg/L核黃素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L葉酸，9.97mg/L煙酸，23.611mg/L維生素BI，5.0mg/L?D?泛酸鈣，9.97mg/L鹽酸吡哆辛，0.00675mg/L維生素B12，2.47mg/L對(duì)氨基甲苯，7.46mg/L?Na2EDTA·2H2O，5.56mg/L?FeSO4·7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL?脯氨酸，20000mg/L蔗糖，10000mg/L葡萄糖，100uM乙酰丁香酮pH?5.8；所述共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基為：33000mg/L?NH4NO3...
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：康定明，劉永健，曹金伶，張少蔓，趙傳森，嚴(yán)慧慧，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：北京;11
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