一種固液結合制備特利加壓素的方法技術

本發明專利技術涉及多肽合成領域，具體涉及一種固液結合制備特利加壓素的方法，本發明專利技術中采用Boc-Gly-OH和雙甘肽液相合成片段肽Boc-Gly-Gly-Gly-OH，同時固相合成環化片段肽H-c[Cys-Tyr(OtBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys]-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基樹脂；最后將二者偶聯制備特利加壓素肽樹脂，經裂解，純化，凍干得特利加壓素；此工藝減少了雜質肽的生成，提高了粗肽純度和收率，簡化了操作步驟，使生產成本進一步降低，便于規?；糯笊a。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及多肽合成領域，特別涉及一種固相和液相結合制備特利加壓素的方法。技術背景特利加壓素(Terlipressin)最早由Ferring公司開發，于1977年首先在荷蘭作為止血藥上市，商品名為Glypressin;之后又以商品名Glypressine在法國、德國、英國上市，用于治療消化道靜脈曲張出血;Ferring公司于1999年，在中國取得該品種的上市許可。特利加壓素為賴氨酸加壓素衍生物，本身無活性，在體內經氨基肽酶作用，脫去其N末端的3個甘氨酰殘基后，緩慢“釋放”出有活性的賴氨酸加壓素。其結構如下:Gly-Gly-Gly-c-Pro-Lys-Gly-NH2Ferring公司申請的專利SK278755(CZ281589)采用Boc保護氨基酸固相合成工藝制備特利加壓素，此合成工藝中用到HF，對生產設備要求較高，三廢較嚴重，規模放大較困難。專利CN1865282B采用Fmoc保護氨基酸固相合成工藝制備特利加壓素，避免了 HF的使用，降低了對環境的污染;其氧化工藝為液相氧化，溶液濃度不能過高，操作復雜，副反應較多，后期純化難度較大，生產成本高。專利CN101693738A同樣采用Fmoc保護氨基酸固相合成了線性特利加壓素肽樹脂，然后采用碘氧化固相成環工藝形成二硫鍵，然后經裂解，純化、凍干得精肽，簡化了操作過程，便于規模性放大;但是存在成環較困難，粗肽純度較低的缺點。專利CN102408471A，為了解決工藝中容易產生特利加壓素土Gly的雜質，特采用Fmoc-Gly-0H和CTC樹脂合成Fmoc-Gly-Gly-Gly-CTC樹脂，然后經裂解得到單體Fmoc-Gly-Gly-Gly-0H，在固相接肽合成線性特利加壓素肽樹脂;雖然有效的避免了特利加壓素±617的雜質的產生，但是提高了生產成本。專利CN104371008A采用片段合成的方法來制備特利加壓素，其公布的液相合成Boc-Gly-Gly-Gly-OH或Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH方法，需要經過偶聯、脫保護、再偶聯、再脫保護等四個步驟，且所選原料H-Gly-OMe或Η-Gly-OtBu價格較高，整個制備過程操作復雜，不適合規模放大生產。本專利技術人為了解決特利加壓素±617雜質的生成，降低純化難度；同時為了簡化特利加壓素的生產工藝，提高收率，降低生產成本，對特利加壓素的合成方法進行了研究，從而得到本專利技術的技術方案。
技術實現思路
為了解決現有技術的不足，本專利技術提供了一種特利加壓素的固相和液相相結合的制備方法。本專利技術采用常規的保護氨基酸作為起始原料，降低了合成難度，提高了精肽純度，降低了生產成本，有利于規?；I生產。為實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案:—種固液結合制備特利加壓素的方法，其特征在于，包括如下步驟:(a)以Boc-Gly-OH和雙甘肽為原料，液相合成片段肽A:BoC-Gly-Gly-Gly-0H;(b)以Fmoc保護氨基酸和氨基樹脂依次偶聯，固相合成片段肽B樹脂: H-c-P;ro-Lys(Boc)-Gly-氨基樹脂(c)片段肽A和片段肽B樹脂偶聯，固相合成特利加壓素的肽樹脂:Boc-Gly-Gly-Gly-c-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基樹脂(d)特利加壓素肽樹脂經裂解、純化、轉鹽、凍干得醋酸特利加壓素精肽。以上技術方案中，步驟(a)的具體操作步驟為:將Boc-Gly-OH和HOSu按照摩爾比1:1?1.2的比例溶解在四氫呋喃中，待完全溶解后，冰水浴下滴加入1.0-1.2倍摩爾量(以Boc-Gly-OH的量計)的DCC四氫呋喃溶液;撤冰水浴，室溫下繼續攪拌反應3-4h;濾除白色沉淀，四氫呋喃洗滌3次，合并洗液和濾液;旋蒸濃縮濾液和洗液至原體積的1/3，加入石油醚析晶，過濾得白色固體Boc-Gly-OSu，抽干后待用；將雙甘肽與堿A按照摩爾比1:1?2的比例溶解在水中，加入5?20%體積的有機溶劑B助溶，待完全溶解后，攪拌下滴加入0.5?1.0倍摩爾量(以雙甘肽的量計)Boc-Gly-OSu的有機溶劑B溶液;繼續攪拌反應，TLC監測反應終點，待反應結束減壓蒸掉有機溶劑后，再加入10%檸檬酸水溶液調溶液pH值至2?3，乙酸乙酯萃取，析晶得Boc-Gly-Gly-Gly-OH。以上步驟中，所述堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、三乙胺、二乙胺、N-乙基二異丙基胺、N，N-二異丙基乙胺等中的一種;有機溶劑B為四氫呋喃、二氧六環、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一種或幾種。以上技術方案中，步驟(b)中片段肽B樹脂合成的具體操作步驟為:以Rinkamideresins或Rink amide AM resins為固相載體，經脫保護試劑處理后，以2_5倍的摩爾投料比，加入相應的Fmoc保護氨基酸進行偶聯反應，每一個偶聯反應均是在縮合劑的存在下進行的固相接肽反應，得到H-Cys (Trt)-Tyr (OtBu )-Phe_Gln( Trt) _Asn( Trt )_Cys (Trt)-Pro-Lys(B0C)-Gly-氨基樹脂；然后用2-5倍的摩爾投料比，加入碘的DMF溶液，氧化反應40?120min，然后 DMF 洗滌樹脂六次，得到片段肽 B 樹脂:H-C -Pro-Lys (Boc )-Gly-氨基樹脂。以上技術方案，步驟(c)的具體操作步驟為:稱取2-5倍摩爾投料比Boc-Gly-Gly-Gly-0H和縮合劑，放入溶解瓶中，加入DMF溶解完全，加入裝有片段肽B樹脂的合成柱中，室溫下攪拌反應，kaiseH式劑檢測反應終點。 其中步驟(b)或(c)中所述氨基樹脂為Rink amide resins和Rink amide AMres ins中的一種，樹脂替代度為0.4_1.2mmol/g。其中步驟(b)或(c)中的具體操作步驟中所述縮合劑為DIC/H0BT、DIC/H0AT、TBTU/H0BT/DIPEA、HBTU/H0BT/DIPEA、HATU/H0AT/DIPEA 的一種；脫保護試劑為 15 ?25%(體積含量)哌啶/DMF溶液。以上技術方案，步驟(d)中裂解所用裂解試劑為加入體積比1-5%清除劑的TFA溶液，所述清除劑為苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚、水和三異丙基硅烷中的一種或幾種。本專利技術的有益效果為:1)、本申請采用雙甘肽作為起始原料，其價格便宜且易獲得，利用雙甘肽在堿性條件下可以和Boc-Gly-Osu發生偶聯反應，生成Boc-Gly-Gly-Gly-OH的性質，簡化了其制備過程，降低了合成成本，提高了終產品的純度；2)、本專利技術中二硫鍵的形成工藝，采用了先制備H-Cys(Trt)-Tyr(OtBu)-Phe_Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-氨基樹脂，然后固相條件下碘氧化的方法，這樣可以減少Fmoc-Gly-Gly-Gly-基團的空間位阻，有利于二硫鍵的形成，提高粗肽的純度。說明書和權利要求書中所使用的縮寫含義如下:Fmoc9_荷甲氧幾基Rink amide resinsRink酰胺樹脂Rink amide AM resins Rink酰胺AM樹脂tBu 叔丁基Trt三苯甲基Boc叔丁氧羰基NMPN-甲基-2-吡咯烷酮D本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種固液結合制備特利加壓素的方法，其特征在于，包括如下步驟：(a)以Boc?Gly?OH和雙甘肽為原料，液相合成片段肽A：Boc?Gly?Gly?Gly?OH；(b)以Fmoc保護氨基酸和氨基樹脂依次偶聯，固相合成片段肽B樹脂：H?c[Cys?Tyr(OtBu)?Phe?Gln(Trt)?Asn(Trt)?Cys]?Pro?Lys(Boc)–Gly?氨基樹脂；(c)片段肽A和片段肽B樹脂偶聯，固相合成特利加壓素的肽樹脂：Boc?Gly?Gly?Gly?c[Cys?Tyr(OtBu)?Phe?Gln(Trt)?Asn(Trt)?Cys]?Pro?Lys(Boc)?Gly?氨基樹脂；(d)特利加壓素肽樹脂經裂解、純化、轉鹽、凍干得醋酸特利加壓素精肽。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張穎，李同金，王仁友，石鑫磊，南勤坤，
申請(專利權)人：濟南康和醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：山東;37