一種煙草根、莖及葉中多胺類物質的檢測方法技術

本發明專利技術公開了一種煙草根、莖及葉中多胺類物質的檢測方法，它利用預冷的高氯酸溶液渦旋提取煙草中的多胺，再以3,5-二硝基苯甲酰氯進行衍生化，衍生化產物利用渦旋輔助-液液微萃取進行提取濃縮后采用超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器進行檢測。此外，為了獲得渦旋輔助-液液微萃取中最佳的富集因子和回收率，分別采用了部分析因設計和Doehlert設計進行方法優化。本發明專利技術與其它分析檢測多胺的方法相比，具有衍生反應快、產物穩定，靈敏度高、重現性好、對環境綠色友好等優點，能對煙草中根、莖及葉中的多胺進行準確的定性與定量。此外，通過高分辨率質譜鑒定了其它四種多胺，分別為酪胺、1,3-丙二胺、高精瞇和刀豆四胺，其中刀豆四胺為首次在煙草中發現。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于煙草化學成分的測定方法
，具體涉及一種煙草根、莖及葉中 多胺類物質的檢測方法。
技術介紹
多胺是生物體代謝過程中產生的具有生物活性的低分子量脂肪含氮堿。常見多胺 有腐胺、尸胺、亞精胺和精胺。在高等植物中主要以游離態形式存在，并且在不同的組織與 器官間存在差異。在植物中，多胺具有刺激生長，延緩衰老的作用。一般認為多胺可作為 廣義上的植物激素，也有人認為多胺可能是類似cAMP那樣的"第二信使"，調節植物的生長 發育。此外，多胺與植物的抗逆性也密切相關，研究發現，植物在自主抵抗遭遇的逆境脅迫 時，多胺不僅與其他相溶性溶質一樣有類似的保護功能，而且還與這些相溶性溶質有協同 作用，在植物逆境抵抗體系的構建中起重要的推動作用。 在煙草中，多胺除了有上述重要作用外，利用多胺合成煙堿中的吡咯烷環是煙草 生長過程中非常重要的代謝過程。該過程主要包含多胺的合成與吡咯烷環的合成。多胺 的合成途徑主要有兩條：一條為精氨酸途徑，其關鍵酶是精氨酸脫羧酶，另一條為鳥氨酸途 徑，其關鍵酶是鳥氨酸脫羧酶。合成的腐胺經過腐胺N-甲基轉移酶形成N-甲基腐胺，進 一步由腐胺N-甲基氧化酶氧化得到N-甲基氨基丁醛，N-甲基氨基丁醛自發轉變為合成煙 堿所必須的吡咯烷環，從而形成煙堿。由上述途徑可知，煙草中的多胺類物質是直接形成 煙堿的前體物，對多胺類物質進行檢測分析，能深入的了解煙堿的合成途徑，能為指導獲得 高煙堿優質煙葉提供一定的理論基礎。此外，煙草中的多胺還能參與合成苯乙烯酰胺類物 質，煙草中已經鑒定的苯乙烯酰胺類物質有咖啡酰丁二胺、二咖啡酰氧基亞精胺、咖啡酰氧 基-去氫咖啡酰氧基亞精胺、阿魏酰酪胺等，這些物質與煙草的抗逆性相關，特別與植株的 病毒抗性密切相關。 目前還沒有一套簡單、快速、高靈敏度和對環境綠色友好的關于煙草根、莖及葉中 多胺類物質的檢測方法。建立一套簡單、快速、高靈敏度、對環境綠色友好且準確的方法以 提高樣品檢測通量，減少環境污染是非常必要的。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題：提供，該 方法具有衍生化反應快，產物穩定、靈敏度高、對環境綠色友好且準確等特點，該方法的這 些優點有效的克服了現有技術的不足。 本專利技術技術方案： -種煙草根、莖及葉中多胺類物質的檢測方法，包括以下步驟： A、煙草根、莖及葉中多胺類物質的提取：稱取凍干樣品于離心管中，然后加入內標 溶液，再加入預冷的高氯酸水溶液進行渦旋提取，離心后，上層清液過水系濾膜； B、煙草根、莖及葉中多胺類物質的衍生化：取步驟A中濾液于離心管中，放入冰浴 中冷卻，再加入氫氧化鈉溶液，渦旋混勻后加入預冷的衍生化試劑，渦旋混勻，冰浴中反應 后加入鹽酸水溶液停止反應； C、煙草根、莖及葉中多胺類物質的衍生化產物的提取：向步驟B中衍生化產物中 加入水，調節溶液pH值后，再加入氯化鈉及提取溶劑進行渦旋輔助-液液微萃取，提取結束 后用手動進樣針取下層提取液至微量進樣瓶中，氮氣吹干后用乙腈水溶液將衍生化產物溶 解后進行超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器測定； D、煙草根、莖及葉中多胺類物質的色譜檢測：采用一級與二級高分辨質譜定性標 準品與未知多胺，超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器以己二胺鹽酸鹽為內標分別進 行絕對定量與相對定量。 所述內標溶液為5uL0. 1M鹽酸配制的lmgmL1的己二胺鹽酸鹽。 所述的衍生化試劑為1050uL乙腈配制的50mM的3, 5-二硝基苯甲酰氯。 所述的渦旋輔助-液液微萃取的條件為加入lmL超純水，利用2M的鹽酸將其pH 調至1后，再加入2.5%的氯化鈉（w/v)與250uL三氯甲烷，渦旋輔助液液微萃取3min， 4000rpm離心4min分層。 所述的一級與二級高分辨質譜定性的標準品為腐胺、尸胺、亞精胺和精胺。 所述的一級與二級高分辨質譜定性的未知多胺有酪胺、1，3-丙二胺、高精瞇和刀 豆四胺。 所述的超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器利用標準品絕對定量腐胺、尸 胺、亞精胺和精胺，利用內標己二胺鹽酸鹽按照校正因子F= 1相對定量酪胺、1，3-丙二胺、 高精瞇和刀豆四胺。 本專利技術的有益效果： 由于多胺揮發性差，極性強，且未有紫外吸收的生色團等特性，直接檢測法存在峰 形不對稱、靈敏度低，選擇性不強等缺陷，因此，多胺的檢測方法主要為衍生化方法，衍生方 法主要有氣相衍生與液相衍生二種方法。氣相衍生主要利用乙酰化衍生氨基，提高多胺的 揮發性，從而可以利用氣相色譜進行檢測。乙酰化需無水的條件下反應，提取的多胺必須進 行完全除水后才能進行衍生，且反應易受到水的影響，此外，乙酰化產物的沸點依然較高， 需要高于280°C的柱溫才能從色譜柱中流出而被檢測，因此易導致毛細管色譜柱的流失， 甚至損壞。液相衍生主要是將生色團引入到多胺的結構中，從而使其有紫外吸收或發出熒 光。主要的液相衍生試劑有鄰苯二甲醛、丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基 氨基甲酸酯、氯甲酸芴甲酯和苯甲酰氯。但這些衍生試劑都存在衍生反應慢，衍生產物穩定 性差，且價格較昂貴等缺陷。此外，這些方法常常采用衍生化后直接進樣或液液萃取進行濃 縮，導致方法靈敏度低且需消耗較多量的有機溶劑。 本專利技術建立了一種以預冷的高氯酸溶液渦旋提取煙草中的多胺，再以3, 5-二硝 基苯甲酰氯進行衍生化，衍生化產物利用渦旋輔助-液液微萃取進行提取濃縮后采用超高 效液相色譜-光電二極管陣列檢測器進行檢測的方法。同時本專利技術為了獲得渦旋輔助-液 液微萃取中最佳的富集因子和回收率，分別采用了部分析因設計和Doehlert設計進行方 法優化。與現有技術相比，本方法的優點是：采用3, 5-二硝基苯甲酰氯衍生化多胺，有效減 少了衍生化反應時間，提高了衍生化產物的穩定性，且利用一級與二級高分辨率質譜發現 了其它四種多胺，分別為酪胺、1，3-丙二胺、高精瞇和刀豆四胺，其中刀豆四胺為首次在煙 草中發現；利用渦旋輔助-液液微萃取的方法，減少了有機溶劑的使用及提取的時間，提高 了方法的靈敏度。本專利技術具有衍生反應快、產物穩定，靈敏度高、重現性好、對環境綠色友好 等優點，能對煙草中根、莖及葉中的多胺進行準確的定性與定量。【附圖說明】 圖1本專利技術中煙草根、莖及葉中多胺類物質的檢測方法流程圖； 圖2腐胺、尸胺、亞精胺和精胺混合標準溶液UPLC-PDA(240nm)色譜圖（A-未優化 色譜圖；B-衍生化優化后色譜圖；C-渦旋輔助-液液微萃取優化后色譜圖、6. 88min-腐胺； 7. 51min-尸胺；8. 62min-己二胺鹽酸鹽內標；9. 30min-亞精胺；10. 87min-精胺）； 圖3煙草中根、莖及葉中多胺類物質的典型UPLC-PDA(240nm)色譜圖（A-莖； B-根；C-葉、1:5. 43min-酪胺；2:6. 64min-l, 3-丙二胺；3:6. 91min-腐胺；4:7. 55min-尸 胺；IS:8. 64min-己二胺鹽酸鹽內標；5:9. 34min-亞精胺；6:9. 73min-高精瞇； 7:10. 90min_ 精胺；8:11. 09min_ 刀豆四胺）； 圖4為高精瞇的裂解規律圖。 具體實施方案 實施例1 本專利技術煙草根、莖及葉中多胺類物質的檢測方法包括如下步驟： (1)稱取100本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種煙草根、莖及葉中多胺類物質的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：A、煙草根、莖及葉中多胺類物質的提取：稱取凍干樣品于離心管中，然后加入內標溶液，再加入預冷的高氯酸水溶液進行渦旋提取，離心后，上層清液過水系濾膜；B、煙草根、莖及葉中多胺類物質的衍生化：取步驟A中濾液于離心管中，放入冰浴中冷卻，再加入氫氧化鈉溶液，渦旋混勻后加入預冷的衍生化試劑，渦旋混勻，冰浴中反應后加入鹽酸水溶液停止反應；C、煙草根、莖及葉中多胺類物質的衍生化產物的提取：向步驟B中衍生化產物中加入水，調節溶液pH值后，再加入氯化鈉及提取溶劑進行渦旋輔助?液液微萃取，提取結束后用手動進樣針取下層提取液至微量進樣瓶中，氮氣吹干后用乙腈水溶液將衍生化產物溶解后進行超高效液相色譜?光電二極管陣列檢測器測定；D、煙草根、莖及葉中多胺類物質的色譜檢測：采用一級與二級高分辨質譜定性標準品與未知多胺，超高效液相色譜?光電二極管陣列檢測器以己二胺鹽酸鹽為內標分別進行絕對定量與相對定量。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡凱，趙會納，向章敏，蔡斌，雷波，潘文杰，林英超，
申請(專利權)人：貴州省煙草科學研究院，
類型：發明
國別省市：貴州;52