一種肺癌檢測質控品及其制備方法技術

本發明專利技術涉及一種肺癌檢測質控品及其制備方法，屬于臨床檢驗學、病理學和生物技術領域。一種肺癌檢測質控品，為肺癌細胞系H3122、肺癌細胞系H2228和肺癌細胞系H1299分別接種實驗動物后生成的腫瘤組織的標本切片。本發明專利技術的創新點在于：本發明專利技術得到的肺癌異種瘤組織質控品可以長期保存在大多數的溫度條件下，在室溫和4℃環境保存兩周后檢測效果無變化，該質控品可以用于EQA和IQC，在將切片質控品作為EQA評估試驗的質控品發放的時候，它可以在室溫下無需冰袋進行郵寄并能長時間保存在-20℃或者-4℃條件下。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，尤指一種用于EML4-ALK融合基因 臨床常用方法檢測的異種瘤組織福爾馬林固定石蠟包埋的質控品及其制備方法，屬于臨床 檢驗學、病理學和生物

技術介紹
非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數的80%，雖然不斷有新的治療藥物上市，其預 后仍然很差。隨著分子靶向治療的不斷發展，已發現針對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑 制劑(EGFR-TKI)的分子靶向藥物能夠有效的治療具有EGFR外顯子突變的非吸煙肺腺癌患 者。2007年，日本學者在肺腺癌患者中發現的一個亞群對EGFR-TKI治療和傳統化療不敏感， 該類亞群存在人類棘皮動物微管相關蛋白樣4(EML4)和人類間變性淋巴瘤激酶(ALK)重排 形成的融合基因，即EML4-ALK融合基因，提示其可能對ALK抑制劑敏感。 EML4-ALK融合基因位于2號染色體短臂上，其5 '端為EML4片段，3 '端為ALK片段，編 碼一個由1059個氨基酸組成的蛋白質。目前發現至少14種EML4-ALK的變異體，均為EML4的 人不同外顯子與ALK的20外顯子相融合。例如:變種1 (vl)，為EML4的13外顯子與ALK的20外 顯子相連;變種2(v2)，為EML4的20外顯子和ALK的20外顯子相連;變種3的兩個亞種，v3a為 EML4的第6外顯子和ALK的20外顯子相連，v3b為EML4的第6外顯子加上一個33bp的小片段再 和ALK的20外顯子相連，等等總共14個變種。 目前，對于EML4-ALK融合基因的檢測方法主要有三種:RT-PCR、免疫組化（IHC)和 熒光原位雜交方法(FISH)，這三種方法都較常用在EML4-ALK融合基因的臨床檢測當中。其 中，RT-PCR檢測的是RNA水平，IHC方法檢測的是EML4-ALK融合基因表達蛋白的水平，而FI SH 方法檢測的是革EDNA分子的水平。除了上述方法，Western blot、RACE_coupled PCR以及 iAEP等方法也可用于EML4-ALK檢測。隨著檢測技術的不斷進展，很多醫院都陸續開展了對 于EML4-ALK融合基因的檢測，各個臨床實驗室檢測的方法各不相同，而對于EML4-ALK融合 基因的標準化卻鮮少提及。目前尚沒有國內外文獻報道關于EML4-ALK融合基因檢測質量評 價的文章，對于不同實驗室檢測性能情況的評價以及改善提高其檢測的水平都迫在眉睫。 臨床上對于EML4-ALK融合基因的檢測包括FISH、RT-PCR和免疫組化三種常規方 法，其中手工法免疫組化僅作為初篩手段，不能用作診斷，但對于其他方法可進行佐證。然 而對于任意一種方法來說，一個好的質控品是保證檢測準確度的關鍵。傳統上的質控品傾 向于使用肺癌患者的組織樣本作為檢測質控品，但是這種質控品來源局限，一致性較差，在 應用的過程中存在較大的局限性。有機構曾經通過基因編輯方法利用細胞系制備了 EML4-ALK融合基因的樣本質控品，這種方法能夠獲得不同變種的EML4-ALK融合基因，但是制備過 程中缺少組織結構間隙，不能完全類似與組織的情況。
技術實現思路
本專利技術要解決的第一個技術問題是提供一種能用于異種瘤組織EML4-ALK融合基 因臨床常用方法檢測的質控品。 本專利技術要解決的另一個技術問題是提供異種瘤組織EML4-ALK融合基因臨床常用 方法檢測質控品的制備方法。 為實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案： 一種肺癌檢測質控品，為肺癌細胞系H3122、肺癌細胞系H2228和肺癌細胞系H1299 分別接種實驗動物后生成的腫瘤組織的標本切片。所述實驗動物為免疫缺陷動物，優選小鼠，最優選Beige SCID小鼠和裸小鼠。 所述標本切片采用以下方法制備： 1、培養肺癌細胞系； 2、建立腫瘤動物模型； 3、制備肺癌質控品。 -種肺癌檢測質控品的制備方法，包括以下步驟： 1、培養肺癌細胞系； 2、建立腫瘤動物模型； 3、制備肺癌質控品。 本專利技術選擇EML4-ALK融合基因陽性肺癌細胞系H3122 (V1)、H2228 (V3)和陰性肺癌 細胞系H1299,采用異種移植的方法將細胞系在動物體內致瘤后，取產生的異種瘤進行質控 品的制備。這種方法能夠制備大量模擬正常組織樣本的質控品。所述步驟1培養肺癌細胞系是指:肺癌細胞系H3122、肺癌細胞系H2228、肺癌細胞 系H1299,分別用含10%胎牛血清RPIM-1640培養液培養，培養基中含有10%胎牛血清， 100IU/ml青霉素和100IU/ml鏈霉素;在37°C含5%⑶2的恒溫細胞培養箱中培養，用0.25% 胰蛋白酶消化進行細胞傳代，將三種細胞系擴大培養至107-108并處于對數生長期。所述步驟2建立腫瘤動物模型的步驟為： (1)準備若干只Beige SCID小鼠和裸小鼠 ，Beige SCID小鼠用于H2228致瘤，裸小 鼠用于H3122和H1299致瘤； (2)細胞消化準備：倒掉舊培養基，向培養瓶中加入lrfBS 2ml，清洗2~3次；加入 2ml胰酶，放入37°C、5 % C02孵箱孵2min;待大部分細胞被消化下來，立即加入4ml培養基終 止胰酶的消化作用；用一次性巴氏吸管將細胞吹打混勻，待在鏡下觀察細胞大部分成單個 后轉入50ml離心管中，離心，棄去上層培養基，加入2ml roS，吹打混勻，離心，棄去上清液， 加入lml PBS，吹打混勻細胞，形成細胞懸液，轉入2ml凍存管中； (3)動物接種：將所得1.5ml細胞懸液吹打混勻，分別使用lml注射器吸取0.2ml細 胞懸液，皮下接種到裸小鼠兩側腋下每側0.2ml，將三只接種的裸小鼠放回SPF隔離器中；每 周觀察一次，待瘤長至8至10cm時處死小鼠。所述步驟3制備肺癌質控品的步驟為： (1)收集腫瘤組織：處死小鼠，分別取出三種腫瘤組織，切成10mm X 10mm X 2mm，用 PBS洗凈血污； (2)固定：每種腫瘤分別加入30ml 10%中性甲醛固定細胞6-48小時后，加入IX PBS沖洗3次； (3)乙醇梯度脫水：加入80 %乙醇15ml，靜置30min后，取出；加入90 %乙醇15ml，靜 置30min后，取出；加入95 %乙醇15ml，靜置20min*2后，取出；加入無水乙醇15ml，靜置 20min*2后，取出； (4)透明：加入無水乙醇和二甲苯的混合液1:115ml，靜置30min，取出；加入二甲苯 15ml靜置30min，取出組織； (5)浸蠟:放入56°C蠟盒中浸蠟三遍，第一道30min，第二道60min，第三道90min以 上； (6)包埋:70°C融化石蠟，將融化的500ul液體石蠟加入到組織塊到包埋盒，再次灌 蠟包埋； (7)切片：5um/張切片，切片后于恒溫30°C水箱內展片，用載玻片撈片，晾干，置于 70°C溫箱烤片lh; (8)HE染色觀察:①樣本處理:染色前預熱lOmin，二甲苯中脫蠟5分鐘；換用新鮮的 二甲苯，再脫蠟5分鐘;無水乙醇5分鐘;90 %乙醇2分鐘;70 %乙醇2分鐘;蒸餾水2分鐘； ②染色:蘇木素染色液染色5-10分鐘;HCL水溶液分化5s ;浸自來水中反藍，約5分 鐘;蒸餾水再洗滌一遍;95 %乙醇5秒;伊紅染色液染色30秒-2分鐘；③脫水透明封片:95%乙醇脫水本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種肺癌檢測質控品，其特征在于：為肺癌細胞系H3122、肺癌細胞系H2228和肺癌細胞系H1299分別接種實驗動物后生成的腫瘤組織的標本切片。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李金明，李禹龍，張瑞，丁健生，韓彥熙，彭絨雪，張括，林貴高，
申請(專利權)人：北京醫院，
類型：發明
國別省市：北京;11