斑馬魚胚胎單細(xì)胞染色質(zhì)超敏位點(diǎn)高通量測序?qū)嶒?yàn)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及斑馬魚胚胎單細(xì)胞染色質(zhì)超敏位點(diǎn)高通量測序?qū)嶒?yàn)方法，首先進(jìn)行斑馬魚胚胎樣本前處理，然后將胚胎轉(zhuǎn)至含有裂解緩沖液的管中，用廣口槍頭在冰浴中裂解胚胎；再進(jìn)行脫氧核糖核酸酶I酶切反應(yīng)，抽提純化DNA，利用建庫試劑盒構(gòu)建文庫后通過瓊脂糖膠電泳分離選擇所需文庫大小進(jìn)行高通量測序及生物信息分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明專利技術(shù)主要通過在沉淀過程中加入環(huán)狀載體DNA來富集DNA量，從而能在單個細(xì)胞水平進(jìn)行的DNase?I超敏位點(diǎn)高通量測序技術(shù)，此方法能觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的差異，剖析細(xì)胞的異質(zhì)性，能更好的觀察胚胎發(fā)育過程中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的變化及機(jī)制研究。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中全基因組上DNaseI超敏位點(diǎn)及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)機(jī)制研究。
技術(shù)介紹
基因調(diào)控是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的中心課題之一。因?yàn)橐私鈩又参锷L發(fā)育規(guī)律，形態(tài)結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)功能，就必須搞清楚表達(dá)調(diào)控的時間和空間概念，掌握了基因調(diào)控機(jī)制，就等于掌握了一把揭示生物學(xué)奧秘的鑰匙。而基因的表達(dá)是由多個功能轉(zhuǎn)錄元件(transcriptionelements,TEs)結(jié)合位點(diǎn)的組合所調(diào)控的，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合在基因啟動子序列中的特殊位點(diǎn)上(transcriptionfactorbindingsites，TFBSs)，起著調(diào)控轉(zhuǎn)錄的重要作用。DNaseI超敏位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)可以提供重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合區(qū)域和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。傳統(tǒng)的DNase-seq主要局限于獲取大量細(xì)胞的全基因組DNaseI超敏位點(diǎn)信息，而singlecellDNase-seq(scDNase-seq)是一種檢測單個細(xì)胞或者少量細(xì)胞的DNaseI超敏位點(diǎn)的方法。事實(shí)上，即使是來源相同的單個細(xì)胞，由于隨機(jī)生物過程和環(huán)境擾動的原因，彼此在許多方面也存在差異，即細(xì)胞的異質(zhì)性。scDNase-seq有助于我們剖析細(xì)胞異質(zhì)性，提供細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合的差異，適用于胚胎早期分化與發(fā)育的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究。斑馬魚是研究發(fā)育生物學(xué)的新興模式動物。斑馬魚由于具有飼育容易，胚胎透明，體外受精，遺傳學(xué)工具成熟等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來已成為研究脊椎動物發(fā)育與人類遺傳疾病的新興模式動物。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚共享了人類70％的蛋白編碼基因，而且人類疾病相關(guān)基因中有84％可以在斑馬魚中找到了對應(yīng)基因，而目前在斑馬魚系統(tǒng)的高通量的分子生物學(xué)測序技術(shù)還比較欠缺。目前單細(xì)胞DNase-seq只是用于細(xì)胞樣本中，對于轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件及基因表達(dá)調(diào)控的研究也只限于細(xì)胞水平，還沒有涉及到斑馬魚早期胚胎的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)是為了減少細(xì)胞的異質(zhì)性所建立的一種適用于斑馬魚胚胎單細(xì)胞染色質(zhì)超敏位點(diǎn)高通量測序(SinglecellDNase-seq)實(shí)驗(yàn)方法。本專利技術(shù)的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：斑馬魚胚胎單細(xì)胞染色質(zhì)超敏位點(diǎn)高通量測序(SinglecellDNase-seq)實(shí)驗(yàn)方法，該方法包括以下步驟：(1)斑馬魚胚胎樣本實(shí)驗(yàn)前處理：取斑馬魚一個細(xì)胞時期的胚胎加預(yù)冷的含有蛋白抑制劑的PBS洗滌劑洗滌3次，PBS洗滌劑中蛋白抑制劑cocktail的含量為1X，所述的蛋白抑制劑cocktail由AEBSF、EDTA、Leupeptin及PepstatinA組成；(2)裂解細(xì)胞取細(xì)胞核：經(jīng)過前處理的斑馬魚胚胎一細(xì)胞期樣本轉(zhuǎn)入裝有32ul預(yù)冷的裂解緩沖液(10mMTris-Hcl，pH7.5，10mMNaCl，3mMMgCl2，0.1％TritonX-100)的0.1ml的PCR管中，冰上用廣口的100ul移液器槍頭反復(fù)吹打胚胎，直至胚胎內(nèi)細(xì)胞裂解，避免氣泡和泡沫產(chǎn)生，繼續(xù)冰上裂解30min；(3)脫氧核糖核酸酶DNaseI酶切反應(yīng)：在上述裂解的細(xì)胞核液體中加入8ul已稀釋好的0.033U/ul的DNaseI，輕輕渦旋2s后37度水浴反應(yīng)5min，立即加入80ul含有蛋白酶K的終止反應(yīng)液(10mMTris-Hcl，pH7.5，10mMNaCl，0.15％SDS，10mMEDTA)，混勻后短暫離心，加入6ul環(huán)狀載體DNA(pUC19)，55度水浴1h。DNaseI來自于5ulDNaseI母液(10U/ul)加145ul步驟(2)所述的裂解緩沖液。蛋白酶K濃度為20mg/ml。環(huán)狀載體DNA(pUC19)濃度為5ng/ul；(4)純化提取酶切DNA：上述所得液轉(zhuǎn)入1.5ml的PhaseLockGel管中，加入125ul抽提掖(體積比25:24:1的酚、氯仿與異戊醇的混合液)，劇烈震蕩1min，14000rpm，常溫離心5min，取125ul上清至新的1.5ml的離心管中，加1ul20mg/ml糖原，12.5ul3MNaOAcpH5.2，340ml無水乙醇，-80度沉淀15min，13000rpm，4度離心15min棄上清70％乙醇洗一次，13000rpm，4度離心5min去上清，晾干后加10ulQiagen洗脫液；(5)文庫構(gòu)建及測序：用Qubit2.0對所得樣品進(jìn)行定量，然后按照RubiconGenomics公司的建庫試劑盒說明書構(gòu)建文庫，所得文庫于2％瓊脂糖膠中電泳分離，120V，30min，選取150-400bp位置切膠后用Qiagen回收試劑盒進(jìn)行文庫回收，將構(gòu)建好文庫進(jìn)行bioanalyzer分析，確定文庫質(zhì)量，Hiseq2500的125PE進(jìn)行高通量測序，結(jié)果進(jìn)行生物信息分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：本專利技術(shù)主要通過在沉淀過程中加入環(huán)狀載體DNA來富集DNA量，從而能在單個細(xì)胞水平進(jìn)行的DNaseI超敏位點(diǎn)高通量測序技術(shù)，此方法能觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的差異，剖析細(xì)胞的異質(zhì)性，能更好的觀察胚胎發(fā)育過程中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的變化及機(jī)制研究。具體實(shí)施方式本專利技術(shù)涉及斑馬魚胚胎單細(xì)胞染色質(zhì)超敏位點(diǎn)高通量測序?qū)嶒?yàn)方法，首先進(jìn)行斑馬魚胚胎樣本前處理，然后將胚胎轉(zhuǎn)至含有裂解緩沖液的管中，用廣口槍頭在冰浴中裂解胚胎；再進(jìn)行脫氧核糖核酸酶I酶切反應(yīng)，抽提純化DNA，利用建庫試劑盒構(gòu)建文庫后通過瓊脂糖膠電泳分離選擇所需文庫大小進(jìn)行高通量測序及生物信息分析。本專利技術(shù)主要通過在沉淀過程中加入環(huán)狀載體DNA來富集DNA量，從而能在單個細(xì)胞水平進(jìn)行的DNaseI超敏位點(diǎn)高通量測序技術(shù)，此方法能觀察到細(xì)胞與細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的差異，剖析細(xì)胞的異質(zhì)性，能更好的觀察胚胎發(fā)育過程中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的變化及機(jī)制研究。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本專利技術(shù)技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1取剛受精后的一細(xì)胞期的斑馬魚胚胎一枚。具體方法如下：(1)斑馬魚胚胎樣本實(shí)驗(yàn)前處理：取斑馬魚一個細(xì)胞時期的胚胎加預(yù)冷的含有蛋白抑制劑的PBS洗滌劑洗滌3次，PBS洗滌劑中蛋白抑制劑cocktail的含量為1X，所述的蛋白抑制劑cocktail由AEBSF、EDTA、Leupeptin及PepstatinA組成；(2)裂解細(xì)胞取細(xì)胞核：經(jīng)過前處理的斑馬魚胚胎一細(xì)胞期樣本轉(zhuǎn)入裝有32ul預(yù)冷的裂解緩沖液(10mMTris-Hcl，pH7.5，10mMNaCl，3mMMgCl2，0.1％TritonX-100本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
斑馬魚胚胎單細(xì)胞染色質(zhì)超敏位點(diǎn)高通量測序(Single?cell?DNase?seq)實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：(1)斑馬魚胚胎樣本實(shí)驗(yàn)前處理：取斑馬魚一個細(xì)胞時期的胚胎加預(yù)冷的含有蛋白抑制劑的PBS洗滌劑洗滌3次；(2)裂解細(xì)胞取細(xì)胞核：經(jīng)過前處理的斑馬魚胚胎一細(xì)胞期樣本轉(zhuǎn)入裝有32ul預(yù)冷的裂解緩沖液的0.1ml的PCR管中，冰上用廣口的100ul移液器槍頭反復(fù)吹打胚胎，直至胚胎內(nèi)細(xì)胞裂解，避免氣泡和泡沫產(chǎn)生，繼續(xù)冰上裂解30min；(3)脫氧核糖核酸酶DNase?I酶切反應(yīng)：在上述裂解的細(xì)胞核液體中加入8ul已稀釋好的0.033U/ul的DNase?I，輕輕渦旋2s后37度水浴反應(yīng)5min，立即加入80ul含有蛋白酶K的終止反應(yīng)液，混勻后短暫離心，加入6ul環(huán)狀載體DNA(pUC19)，55度水浴1h；(4)純化提取酶切DNA：上述所得液轉(zhuǎn)入1.5ml的Phase?Lock?Gel管中，加入125ul抽提掖，劇烈震蕩1min，最大速度離心5min，取125ul上清至新的1.5ml的離心管中，加1ul糖原，12.5ul?NaOAc，340ml無水乙醇，?80度沉淀15min，離心15min棄上清70％乙醇洗一次，離心5min去上清，晾干后加10ul?Qiagen洗脫液；(5)文庫構(gòu)建及測序：用Qubit?2.0對所得樣品進(jìn)行定量，然后按照Rubicon?Genomics公司的建庫試劑盒說明書構(gòu)建文庫，所得文庫于2％瓊脂糖膠中電泳分離，選取150?400bp位置切膠后用Qiagen回收試劑盒進(jìn)行文庫回收，將構(gòu)建好文庫進(jìn)行bioanalyzer分析，確定文庫質(zhì)量，Hiseq2500的125PE進(jìn)行高通量測序，結(jié)果進(jìn)行生物信息分析。...

【技術(shù)特征摘要】
1.斑馬魚胚胎單細(xì)胞染色質(zhì)超敏位點(diǎn)高通量測序(Singlecell
DNase-seq)實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
(1)斑馬魚胚胎樣本實(shí)驗(yàn)前處理：
取斑馬魚一個細(xì)胞時期的胚胎加預(yù)冷的含有蛋白抑制劑的PBS洗
滌劑洗滌3次；
(2)裂解細(xì)胞取細(xì)胞核：
經(jīng)過前處理的斑馬魚胚胎一細(xì)胞期樣本轉(zhuǎn)入裝有32ul預(yù)冷的裂解
緩沖液的0.1ml的PCR管中，冰上用廣口的100ul移液器槍頭反復(fù)吹打
胚胎，直至胚胎內(nèi)細(xì)胞裂解，避免氣泡和泡沫產(chǎn)生，繼續(xù)冰上裂解30min；
(3)脫氧核糖核酸酶DNaseI酶切反應(yīng)：
在上述裂解的細(xì)胞核液體中加入8ul已稀釋好的0.033U/ul的
DNaseI，輕輕渦旋2s后37度水浴反應(yīng)5min，立即加入80ul含有蛋白
酶K的終止反應(yīng)液，混勻后短暫離心，加入6ul環(huán)狀載體DNA(pUC19)，
55度水浴1h；
(4)純化提取酶切DNA：
上述所得液轉(zhuǎn)入1.5ml的PhaseLockGel管中，加入125ul抽提掖，
劇烈震蕩1min，最大速度離心5min，取125ul上清至新的1.5ml的離
心管中，加1ul糖原，12.5ulNaOAc，340ml無水乙醇，-80度沉淀15min，
離心15min棄上清70％乙醇洗一次，離心5min去上清，晾干后加10ul
Qiagen洗脫液；
(5)文庫構(gòu)建及測序：
用Qubit2.0對所得樣品進(jìn)行定量，然后按照RubiconGenomics公
司的建庫試劑盒說明書構(gòu)建文庫，所得文庫于2％瓊脂糖膠中電泳分離，
選取150-400bp位置切膠后用Qiagen回收試劑盒進(jìn)行文庫回收，將構(gòu)
建好文庫進(jìn)行bioanalyzer分析，確定文庫質(zhì)量，Hiseq2500的125PE進(jìn)
行高通量測序...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉桂芬，張勇，王湘秀，陳玉潔，王晨飛，修文超，
申請(專利權(quán))人：同濟(jì)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：上海;31