Lin28a基因過表達腺相關病毒在促進創傷修復中的應用制造技術

本發明專利技術屬于生物醫學領域，具體涉及一種攜帶Lin28a基因的重組腺相關病毒在制備用于促進創傷修復藥物中的應用。將Lin28a基因插入到腺相關病毒載體上，獲得一攜帶Lin28a基因的重組腺相關病毒。本發明專利技術公開的重組腺相關病毒制備方法簡單，能有效促進皮膚創傷的愈合，能顯著促進部分深度燒傷的真皮再生，能促進骨損傷和軟組織損傷修復，并能抑制瘢痕形成。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物醫學領域，具體涉及一種Lin28a基因過表達腺相關病毒在促進創傷修復中的應用。
技術介紹
目前，各種創傷、燒傷、手術切口的愈合仍然是臨床存在的一大難題，尤其是局部放療傷口的愈合、糖尿病人傷口的愈合、大面積燒傷或褥瘡等難愈合傷口的愈合，給患者造成巨大痛苦，也給醫療工作帶來巨大負擔。創傷修復是個復雜而漸進的過程，而以往的研究基本停留在等待傷口自愈階段，而缺乏促進創傷修復的積極措施。Lin28是存在于高等真核生物中的一種保守RNA結合蛋白，它是可以將人類體細胞重新編程為多潛能干細胞的四種多能性因子之一，在調節細胞生長分化、新陳代謝以及細胞多能性等方面起重要作用。在哺乳動物基因組中，存在兩個同源基因Lin28a與Lin28b，兩者序列相似度高達76%。Lin28a與Lin28b雖然在核酸序列上具有極高的相似性，但其在細胞中的定位及具體功能卻有差異。在人類基因組中Lin28a定位于染色體1p36.11，蛋白質編碼區含有209個氨基酸殘基，其同源蛋白基因Lin28b定位于染色體6p21，編碼一個含有250個氨基酸殘基的小分子蛋白質。由于Lin28a與Lin28b在功能上存在一定的差異，導致表達細胞的類型也具有一定的特異性：Lin28b與多種癌癥的觸發、轉移相關，并在多種癌細胞系中呈現出高表達狀態，提示其可能成為癌癥發生預測的標志性分子；Lin28a的主要功能是調控細胞的分化過程，因此廣泛表達于胚胎干細胞與早期胚胎形成時的細胞中，Lin28a基因可通過調控糖酵解和氧化磷酸化反應加強葡萄糖氧化代謝，能激活膠原蛋白，新生的膠原蛋白能重新建立起膠原支架，提示Lin28a基因具有促進創傷修復能力。腺相關病毒（AAV）是一類微小、無被膜及具有二十面體結構的細小單鏈DNA病毒。近年來用AAV作基因轉移載體已成為基因治療研究的熱點。這是由于AAV具有以下特點：（1）安全性好：迄今從未發現野生型AAV對人體致病；重組AAV去除了野生型AAV基因組的96%，進一步保證了安全性；（2）宿主范圍廣：不僅可轉導分裂細胞，而且可轉導靜止期細胞；（3）野生型AAV可整合到人基因組19號染色體q臂的特定位置，利用這一特點，有可能研制出具有特異性整合功能的AAV載體；（4）AAV-2的基因組僅4681個核苷酸，便于用常規的重組DNA技術進行操作；（5）物理性質穩定：在60°C不能被滅活，能抗氯仿；（6）重組AAV（rAAV）可長期穩定地表達外源基因。腺相關病毒對許多哺乳動物細胞都比較易感，能夠轉染的細胞種類也比較多，無論是細胞系，還是原代培養的貼壁細胞，亦或是常規轉染試劑難以轉染的細胞類型，腺相關病毒都有很好的轉染效率，與質粒轉染相比，具有瞬時轉染基因轉移效率更高的優點。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供攜帶Lin28a基因的重組腺相關病毒（AAV-Lin28a），將Lin28a基因構建入腺相關病毒載體，用于Lin28a基因的過表達，該AAV-Lin28a能促進創傷修復。本專利技術提供的Lin28a基因過表達腺相關病毒在促進創傷修復中的應用，通過以下技術方案來實現：1.人工合成Lin28a全基因組；2.將Lin28a基因插入到腺相關病毒載體上，利用pHelper質粒包裝系統共轉染細胞，獲得重組腺相關病毒AAV-Lin28a，進一步得到病毒濃縮液；3.建立皮膚表面創傷動物模型和合適的基因轉移方法，證明AAV-Lin28a可促進皮膚創傷愈合；4.建立度燒傷動物模型和合適的基因轉移方法，證明AAV-Lin28a可促進深度燒傷的真皮再生，并能抑制皮膚瘢痕形成；5.建立骨損傷動物模型和合適的基因轉移方法，證明AAV-Lin28a可促進骨損傷修復；6.建立軟組織損傷動物模型和合適的基因轉移方法，證明AAV-Lin28a可促進軟組織損傷修復。本專利技術的有益效果在于：本專利技術將Lin28a基因插入到腺相關病毒載體上，獲得一攜帶Lin28a基因的重組腺相關病毒。該重組腺相關病毒制備方法簡單，能有效促進皮膚創傷的愈合，能顯著促進部分深度燒傷的真皮再生，能促進骨損傷和軟組織損傷修復，并能抑制瘢痕形成。附圖說明附圖1為三組動物皮膚創傷愈合率的變化趨勢圖。附圖2為皮膚HE染色效果圖（A：AAV-Lin28a；B：AAV-MCS；C：PBS）。具體實施方式下面給出實施例以對本專利技術作更詳細的說明，有必要指出的是以下實施例不能理解為對本專利技術保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員根據上述本
技術實現思路
對本專利技術作出的一些非本質的改進和調整仍屬本專利技術的保護范圍。實施例實施例1重組腺相關病毒的制備。構建重組腺相關病毒載體。由上海生物工程有限公司全基因合成Lin28a基因，構建到pUC57載體中，得到pUC57-Lin28a質粒（測序結果見SEQIDNO.1）。采用限制性內切酶EcoRI和BamHI（購自Takara公司）雙酶切pUC57-Lin28a和pAAV-MCS腺相關病毒載體(購自Stratagene公司)，酶切體系為：pAAV-MCS/pUC57-Lin28a質粒：10ul，EcoRI：3ul，BamHI：3ul，buffer：4ul，H2O：20ul。37℃水浴30min，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，回收Lin28a基因片段和pAAV-MCS載體骨架（操作步驟參照Takara瓊脂糖核酸純化回收試劑盒說明書）。將Lin28a基因插入酶切回收pAAV-MCS載體中（具體步驟參照Takara公司DNALigationKitVer.2.1試劑盒說明書），連接體系為：Lin28a回收產物：2.5ul，pAAV-MCS回收產物：2.5ul，SolutionI：5ul。16℃孵育30min，取連接產物10ul加入100ulDH5α感受態細胞（購自Takara公司）中吹打均勻，冰上靜置20min，再放入42℃水浴90s，迅速置于冰中，靜置3min，加入500ulLB液體培養基，180rpm、37℃振蕩培養1h，取菌液100ul均勻涂布于LB固體培養基（含1/1000氨芐青霉素），37℃培養過夜。挑取單克隆菌落于5mlLB培養基（含1/1000氨芐青霉素）中，180rpm37℃培養12h后提取質粒（操作步驟參照Takara質粒提取試劑盒說明書）。取樣送至上海生物工程有限公司測序驗證確認正確。將構建的質粒命名為pAAV-Lin28a。細胞株293FT的復蘇與培養。取液氮凍存的293FT細胞株（購自Clontech公司），迅速放于37℃水浴中解凍，期間...

【技術保護點】
重組腺相關病毒在制備用于促進創傷修復藥物中的應用，其中所述重組腺相關病毒攜帶Lin28a基因。

【技術特征摘要】
1.重組腺相關病毒在制備用于促進創傷修復藥物中的應用，其中所述重組腺相關病毒
攜帶Lin28a基因。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物用于促進皮膚創傷愈合。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述藥物用于促進深度燒...

【專利技術屬性】
技術研發人員：周勇，申友鋒，
申請(專利權)人：重慶高圣生物醫藥有限責任公司，
類型：發明
國別省市：重慶;85