本發明專利技術公開一種用于檢測HBV?B/C的數字PCR絕對定量分型檢測試劑盒及其檢測方法；所述試劑盒包括DNA提取液、數字PCR反應緩沖液A、數字PCR反應緩沖液B、HBV?B病毒基因陽性質控、HBV?C病毒基因陽性質控、陰性質控和內標溶液；方法包括如下步驟：1）受檢樣品處理；2）質控品的處理；3）配制數字PCR反應混合液；4）生成微反應液滴，并進行數字PCR反應擴增；5）讀取熒光信號，分析HBV型別并計算各自拷貝數。本發明專利技術采用數字PCR技術和雙色熒光探針，同時檢測HBV的兩個亞型，且不依賴于外來標準物及標準曲線，操作簡便，可直接對HBV精準絕對定量。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子診斷生物學
，具體涉及一種用于檢測HBV-B/C的數字PCR 絕對定量分型檢測試劑盒及其檢測方法。
技術介紹
乙型肝炎病毒是導致人類急性和慢性乙型肝炎的病原體，它能引起肝臟細胞的嚴 重損傷，并且持久穩固的HBV感染與肝硬化及肝癌的發生密切相關，對人類的健康危害極 大。據估計，全世界感染過HBV的人數大約有20億，并且超過3.5億的感染者具有持久穩固和 慢性感染;每年因 HBV感染導致的相關疾病死亡人數可達60萬-100萬。HBV在世界各地的流 行感染率差別極大，在亞洲東部地區HBV的感染流行率最高，而在北美和歐洲的西北部地區 流行率很低。中國HBV感染人數超過7億，其中約1.2億攜帶者，3000萬慢性感染者，每年新增 HBV感染人數約50萬，是世界上HBV感染率最高的國家之一。 不同HBV基因型可以導致不同的臨床表現及預后。有研究表明基因 B型感染者較C 型感染者較少發生肝損害，且基因 B型感染者較C型不易發展至肝硬化、炎癥程度較輕;基因 C型感染者其肝臟炎癥壞死評分高于基因 B型感染者，基因 C型感染者容易發展為肝硬化和 肝癌。在中國主要流行HBV-B/C型。因此，HBV基因分型檢測可以在乙肝炎患者的臨床類型、 預后判斷及治療方法的選擇等方面發揮重要的作用。 乙型肝炎病毒表面抗原的血清學檢測在HBV感染的診斷中起著重要作用。目前采 用免疫學方法檢測HBV血清學標志物廣泛用于急、慢型感染的診斷、療效觀察和預后判斷。 然而，由于HBV亞型和變異株的存在以及病毒的免疫逃逸，即使在HBV攜帶者血液中，檢測不 到HBs Ag且抗HBs Ag抗體陽性，仍然不能確定該攜帶者體內的HBV已經完全清除，也不能排除 其他將來發生與HBV感染相關的嚴重肝臟疾病并發癥的可能。HBV的血清學診斷是間接診 斷，不能直接反映病原體的存在，故用這些血清學標志物檢測疾病的發展有一定的限制。分 子診斷技術的引入為直接和真實地反映患者體內病毒復制水平，以及判斷患者病情、療效 和預后提供了可能。 目前HBV基因分型的分子診斷主要包括核酸雜交法、基因芯片和熒光PCR法等。其 中核酸雜交包括斑點雜交、液相雜交、支鏈DNA技術等方法，但是由于雜交步驟較為繁瑣，在 大樣本研究中耗時較長，易導致交叉雜交反應，而存在著一定的不足;基因芯片由于其成本 較高，制作工藝復雜，而且信號檢測需要專門的儀器設備，限制了其在臨床上的應用。目前 認為實時熒光定量PCR技術是檢測HBV DNA以及分型的最好方法，該技術目前被公認為第二 代定量PCR技術，但其定量需要參考標品、標準曲線和內標校正，對有限的標本材料以及低 拷貝數HBV的準確定量仍存在一定的應用限制。
技術實現思路
針對現有技術存在的上述不足，本專利技術所要解決的技術問題是：如何提供一種用 于檢測HBV-B/C的數字PCR絕對定量分型檢測試劑盒及其檢測方法，用于克服現有檢測技術 中步驟繁雜、耗時較長、易導致交叉雜交反應、需要進行定量矯正、準確度不高等不足之處， 且具有準確度高、靈敏度高、精確度高、重現性好的特點。 為了解決上述技術問題，本專利技術采用如下技術方案:一種用于檢測HBV-B/C的數字 PCR絕對定量分型檢測試劑盒，包括DNA提取液、數字PCR反應緩沖液A、數字PCR反應緩沖液 B、HBV-B病毒基因陽性質控、HBV-C病毒基因陽性質控、陰性質控和內標溶液； 所述數字PCR反應緩沖液A中包括有HBV-B型的引物及探針和HBV-C型的引物及探針;所 述數字PCR反應緩沖液B中包括有內標的引物及探針;所述HBV-B型、HBV-C型和內標的引物 及探針如下所示： HBV-B型和HBV-C型通用上游引物： ctagactcgtggtggacttctc； HBV-B型和HBV-C型通用下游引物： atgaggcatagcagcaggat； HBV-B 型探針：tcgcagtcccaaatctccagtcactc; HBV-C 型探針：tcgcagtccccaacctccaatca; 內標上游引物：ctgccgttactgccctgtg; 內標下游引物:ttggtctccttaaacctgtcttg; 內標探針：accaccaacttcatccacgttcacc; 所述HBV-B型探針5'端熒光報告基因為FAM，HBV-C型探針5'端熒光報告基團為VIC，內 標探針5 '端熒光報告基團為VIC，所有探針3 '端淬滅基團均為BHQ; 所述HBV-B病毒基因陽性質控為HBV-B的標準質粒溶液;所述HBV-C病毒基因陽性質控 為HBV-C的標準質粒溶液； 所述陰性質控為滅菌生理鹽水； 所述內標溶液為β-globin的標準質粒溶液。 一種用于檢測HBV-B/C的數字PCR絕對定量分型檢測方法，采用上述用于檢測HBV- B/C的數字PCR絕對定量分型檢測試劑盒進行檢測，具體檢測方法包括如下步驟： (1) 受檢樣品處理:將待測樣品用無菌生理鹽水洗滌并離心棄去上清液后，加入滅菌水 震蕩混勻，向震蕩混勻后的溶液中加入所述試劑盒中的DNA提取液和內標溶液，劇烈震蕩混 勾，并于100~105°C恒溫處理10~16分鐘，再于12,000~14,000印111/111；[11離心5~10分鐘，取上清 液，獲得PCR擴增樣品DNA模板； (2) 質控品的處理:分別取所述試劑盒中的HBV-B病毒基因陽性質控、HBV-C病毒基因陽 性質控和陰性質控，按照與步驟（1)相同的方法處理，分別得到HBV-B病毒基因陽性質控、 HBV-C病毒基因陽性質控和陰性質控的DNA模板； (3) 配制數字PCR反應混合液：向步驟（1)和步驟(2)處理后得到的樣品DNA模板、HBV-B 病毒基因陽性質控DNA模板、HBV-C病毒基因陽性質控DNA模板和陰性質控DNA模板中分別加 入滅菌水和所述試劑盒中的數字PCR反應緩沖液，分別配制得到樣品、HBV-B病毒基因陽性 質控、HBV-C病毒基因陽性質控和陰性質控的數字PCR反應混合液;其中，陽性質控和陰性質 控的數字PCR反應混合液均采用數字PCR反應緩沖液A配制，樣品的數字PCR反應混合液分為 兩種，分別采用數字PCR反應緩沖液A和數字PCR反應緩沖液B配制； (4) 將步驟(3)制備的樣品、HBV-B病毒基因陽性質控、HBV-C病毒基因陽性質控和陰性 質控的數字PCR反應混合液分別制作為油包水PCR微反應液滴，生成的微反應液滴數量為 10，000~20，000個，然后對所述微反應液滴進行PCR擴增反應； (5) 讀取熒光信號:步驟(4)PCR擴增后，將PCR反應板放入熒光讀取儀器中，分別在FAM 和/或VIC通道中進行HBV-B和/或HBV-C的分型檢測，通過Quanta soft軟件進行定量分析， 計算出HBV-B型和/或HBV-C型的拷貝數。相比現有技術，本專利技術的有益效果在于： 1、本專利技術通過創造性的試驗研究設計出擴增HBV-B型和C型的引物及雙色熒光探針，使 這些引物能夠很好地與模板DNA上目標片段結合，而不會與模板DNA上目標片段以外的區域 結合，具有良好的PCR擴增特異性，進而將這些引物和探針加入數字PCR反應緩沖液中，可以 使樣品的特異性PCR反應產物可以分本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種用于檢測HBV?B/C的數字PCR絕對定量分型檢測試劑盒，其特征在于，包括DNA提取液、數字PCR反應緩沖液A、數字PCR反應緩沖液B、HBV?B病毒基因陽性質控、HBV?C病毒基因陽性質控、陰性質控和內標溶液；所述數字PCR反應緩沖液A中包括有HBV?B型的引物及探針和HBV?C型的引物及探針；所述數字PCR反應緩沖液B中包括有內標的引物及探針；所述HBV?B型、HBV?C型和內標的引物及探針如下所示：HBV?B型和HBV?C型通用上游引物：ctagactcgtggtggacttctc；HBV?B型和HBV?C型通用下游引物：atgaggcatagcagcaggat；HBV?B型探針：tcgcagtcccaaatctccagtcactc；HBV?C型探針：tcgcagtccccaacctccaatca；內標上游引物：ctgccgttactgccctgtg；內標下游引物：ttggtctccttaaacctgtcttg；內標探針：accaccaacttcatccacgttcacc；所述HBV?B型探針5’端熒光報告基因為FAM，HBV?C型探針5’端熒光報告基團為VIC，內標探針5’端熒光報告基團為VIC，所有探針3’端淬滅基團均為BHQ；所述HBV?B病毒基因陽性質控為HBV?B的標準質粒溶液；所述HBV?C病毒基因陽性質控為HBV?C的標準質粒溶液；所述陰性質控為滅菌生理鹽水；所述內標溶液為β?globin的標準質粒溶液。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：唐小龍，程龍強，劉新礦，高毅，吳漢霞，蔡霞，段舒婷，王倩倩，陳銳，李運超，金少鵬，李輝，屈愛軍，石磊，鐵牛，
申請(專利權)人：唐小龍，
類型：發明
國別省市：安徽;34
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