基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開一種基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法：在分離去除發(fā)酵液中發(fā)酵殘余物后再對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行熒光原位雜交。本發(fā)明專利技術(shù)利用分層離心方法使菌體、發(fā)酵殘余物按照自身不同密度分散在碘海醇溶液的不同位置，效果明顯，從而解決發(fā)酵殘余物對(duì)雜交效果的影響；本發(fā)明專利技術(shù)還系統(tǒng)優(yōu)化針對(duì)厭氧消化液中產(chǎn)甲烷菌的熒光原位雜交技術(shù)各項(xiàng)條件，使雜交的準(zhǔn)確性和靈敏性大大提高，對(duì)今后FISH技術(shù)在厭氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)甲烷菌的檢測(cè)具有重要意義。通過(guò)上述改進(jìn)，本發(fā)明專利技術(shù)最終解決了FISH技術(shù)檢測(cè)菌體時(shí)常常出現(xiàn)的雜質(zhì)過(guò)多，鏡檢背景昏暗，計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確以及試驗(yàn)條件不明引起的雜交效果不理想等問(wèn)題。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及檢測(cè)厭氧消化液中微生物種類的分子生物學(xué)方法，是一種基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，即一種檢測(cè)厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的熒光原位雜交方法。
技術(shù)介紹
沼氣發(fā)酵是一種由多種降解微生物參與的極其復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，分為水解，酸化，產(chǎn)甲烷三個(gè)階段。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)產(chǎn)甲烷菌與非產(chǎn)甲烷菌相互作用，相互制約的過(guò)程。非產(chǎn)甲烷菌為產(chǎn)甲烷菌提供代謝底物，產(chǎn)甲烷菌利用有機(jī)酸和H2生成CH4，從而為非產(chǎn)甲烷菌解除反饋抑制從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。發(fā)酵液中有機(jī)酸、氨氮等物質(zhì)的積累會(huì)抑制產(chǎn)甲烷菌的活性，從而打破這種平衡，造成產(chǎn)氣失敗。同時(shí)優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌受環(huán)境條件影響，也在不斷變化。因此研究消化液中厭氧菌的組成、結(jié)構(gòu)和功能對(duì)防止有機(jī)酸積累和氨抑制及掌握菌群隨底物變化的規(guī)律有重要作用。利用熒光標(biāo)記的探針在細(xì)胞內(nèi)與特異的互補(bǔ)核酸序列雜交，通過(guò)激發(fā)雜交探針的熒光來(lái)檢測(cè)信號(hào)的FISH技術(shù)近幾年在水污染控制微生物生態(tài)學(xué)的研究中得到一定發(fā)展。利用FISH技術(shù)可掌握微生物在發(fā)酵液中的數(shù)量、形態(tài)和分布，但在應(yīng)用中還存在諸多問(wèn)題需要改進(jìn)，例如雜交過(guò)程的各種條件包括雜交和洗脫溫度、變性劑濃度、探針濃度都需要優(yōu)化，這些雜交條件關(guān)系著探針與被檢測(cè)物結(jié)合的強(qiáng)度和FISH的檢測(cè)效果。另外，F(xiàn)ISH技術(shù)是利用熒光探針按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則在菌體內(nèi)部與同源16SrRNA特異結(jié)合，發(fā)酵殘余物附著在菌體表面及周圍，在很大程度上會(huì)使熒光探針的穿透率不足，從而導(dǎo)致雜交率低及細(xì)胞觀察準(zhǔn)確率低等問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本專利技術(shù)提供了一種基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，即檢測(cè)厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的熒光原位雜交技術(shù)，首先提出了一種有效分離菌體與發(fā)酵殘余物的方法，利用分層離心的方法使菌體、發(fā)酵殘余物按照自身不同密度分散在碘海醇溶液中的不同位置，分離效果明顯，從而解決了發(fā)酵殘余物對(duì)雜交效果的影響；另外，本專利技術(shù)系統(tǒng)的優(yōu)化了針對(duì)厭氧消化液中產(chǎn)甲烷菌的熒光原位雜交技術(shù)從稀釋倍數(shù)、變性劑濃度、雜交溫度、濕度及時(shí)間到雜交液和洗脫液的配制，探針的濃度等的各項(xiàng)條件，使雜交的準(zhǔn)確性和靈敏性大大提高，對(duì)今后FISH技術(shù)在厭氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)甲烷菌的檢測(cè)具有重要意義。通過(guò)上述改進(jìn)，本專利技術(shù)最終解決了FISH技術(shù)檢測(cè)菌體時(shí)常常出現(xiàn)的雜質(zhì)過(guò)多，鏡檢背景昏暗，計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確以及試驗(yàn)條件不明引起的雜交效果不理想等問(wèn)題。本專利技術(shù)是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本專利技術(shù)提供一種基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法具體為：在分離去除發(fā)酵液中發(fā)酵殘余物獲得分離產(chǎn)物后再對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行熒光原位雜交。優(yōu)選地，所述分離具體采用離心的方式；優(yōu)選地，所述離心的條件為13000rpm、30min，此步是發(fā)酵液中所有物質(zhì)通過(guò)離心在碘海醇溶液中均勻分布的過(guò)程，離心時(shí)間低于30min則菌體和發(fā)酵殘余物來(lái)不及在碘海醇溶液和水相中充分分布，降低分離效果，離心時(shí)間高于30min可導(dǎo)致本應(yīng)處于碘海醇溶液與水相交界處的菌體因過(guò)度沉降而轉(zhuǎn)移到碘海醇溶液層，降低分離效果；優(yōu)選地，所述離心是在向所述發(fā)酵液中加入碘海醇溶液后進(jìn)行的；優(yōu)選地，所述碘海醇溶液的濃度為0.6g/1mL；碘海醇溶液濃度過(guò)高會(huì)引起所分離菌體的失水和收縮，密度過(guò)低會(huì)降低菌體與雜質(zhì)的分離效果；所述加入具體指采用針頭和注射器向所述發(fā)酵液中慢慢加入。通過(guò)上述操作，離心管中的混合液從離心管頂部至底部分為4層：第1層為上清層，第2層為微生物層，第3層為碘海醇溶液層，第4層為發(fā)酵殘余物層；收集上述第1、2、3層即為分離產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述分離后需對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行清洗；優(yōu)選地，所述清洗的方式為加入磷酸緩沖液后離心；優(yōu)選地，所述離心的條件為13000rpm、4min，此步離心主要起到收集菌體的目的，轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間的選擇主要基于離心效率和效果的考慮；所述清洗的次數(shù)為2次。優(yōu)選地，所述清洗后還需對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行固定獲得固定試樣；所述固定具體為向所述分離產(chǎn)物中加入PBS、多聚甲醛后置于4℃下3-4h；4℃條件下固定的速度適宜，高于4℃則會(huì)導(dǎo)致過(guò)度固定，使菌體的抗原性逐漸喪失；固定3-4h、4％的多聚甲醛能較好的保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA，并保持較好的形態(tài)，固定時(shí)間過(guò)度延長(zhǎng)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大分子的過(guò)度交聯(lián)，降低探針的穿透力，影響雜交效率，多聚甲醛固定后用PBS清洗，清洗后再加入PBS、冰乙醇，-20℃保存，即得。優(yōu)選地，所述雜交前固定試樣處理具體指，向所述清洗后的分離產(chǎn)物中加入Na5P3O10溶液稀釋、超聲分散，即可；加入Na5P3O10溶液后分離產(chǎn)物中的Na5P3O10的最終濃度為400mg/L；所述超聲分散的時(shí)間為3min。優(yōu)選地，所述熒光原位雜交前還需將分離產(chǎn)物脫水固定；其中，所述脫水固定的具體操作為：將所述分離產(chǎn)物滴至載玻片孔、干燥；然后再向載玻片孔中加入瓊脂糖溶液、再干燥；最后將載玻片浸入乙醇中脫水、干燥；其中，每個(gè)載玻片孔中滴加分離產(chǎn)物的量為5-10μL，所述干燥的條件為46℃、15min；每個(gè)載玻片孔中加入瓊脂糖溶液的量為8μL，少于8μL則瓊脂糖溶液不能將孔完全覆蓋，多于8μL則導(dǎo)致干燥后覆蓋在樣品上的瓊脂糖層偏厚，不利于探針與被檢測(cè)物的結(jié)合；所述再干燥的條件為46℃、30min；所述脫水具體為將載玻片分別浸入60％、80％、100％乙醇中3min，梯度乙醇脫水時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)影響菌體的形態(tài)和收縮性，進(jìn)而影響探針的穿透力和雜交效率，經(jīng)試驗(yàn)得出乙醇脫水3min為最適的脫水時(shí)間條件；所述乙醇為冰乙醇；所述脫水、干燥中干燥的條件為46℃。優(yōu)選地，所述熒光原位雜交中采用探針及針對(duì)檢測(cè)微生物為：優(yōu)選地，所述熒光原位雜交中采用雜交液的FA濃度為5-50％(v/v)；每1mL所述雜交液中還包含180μL5MNaCl溶液、20μL1MTris/HCl、10μL1％SDS，余量為水。FA的濃度根據(jù)檢測(cè)微生物種類不同可進(jìn)行調(diào)整，具體地，檢測(cè)微生物種類與FA濃度對(duì)應(yīng)如下：細(xì)菌，5％；古細(xì)菌，35％；八疊球菌，35％；甲烷絲狀菌，20％；烷微菌屬，20％；甲烷桿菌，22％；甲烷球菌，20％；甲烷球菌，35％。優(yōu)選地，所述熒光原位雜交的條件為46℃、2h；雜交時(shí)間和雜交溫度都會(huì)影響探針的特異性，一定范圍內(nèi)提高雜交溫度可增加探針的特異性，雜交時(shí)間長(zhǎng)于2h會(huì)增加非特異性著色，雜交時(shí)間短于2h會(huì)導(dǎo)致探針結(jié)合不完全，經(jīng)試驗(yàn)得出，46℃、2h條件下雜交最充分，信號(hào)強(qiáng)度也較亮。優(yōu)選地，所述檢測(cè)方法還包本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法具體為：在分離去除發(fā)酵液中發(fā)酵殘余物獲得分離產(chǎn)物后再對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行熒光原位雜交。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，其特征在于，所述
檢測(cè)方法具體為：在分離去除發(fā)酵液中發(fā)酵殘余物獲得分離產(chǎn)物后再對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行熒
光原位雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，其
特征在于，所述分離具體采用離心的方式。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，其
特征在于，所述離心是在向所述發(fā)酵液中加入碘海醇溶液后進(jìn)行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，
其特征在于，所述分離后需對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行清洗。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，其
特征在于，所述清洗后還需對(duì)分離產(chǎn)物進(jìn)行固定獲得固定試樣；
其中，所述固定具體指，向所述清洗后的分離產(chǎn)物中加入多聚甲醛溶液、固定，即
可；獲得的固定試樣還需用Na5P3O10溶液稀釋、超聲分散。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于FISH的厭氧消化發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌群的檢測(cè)方法，其
特...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉榮厚，李坤，劉蓓蕾，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：上海;31