本發明專利技術涉及包含足以結合和/或解聚淀粉樣蛋白的絲狀噬菌體基因3蛋白(g3p)的一部分，例如，g3p的N1-N2部分及其突變體和片段的多肽，其中已通過氨基酸取代修飾該g3p氨基酸序列，以當在體內使用時具有比對應的野生型g3p氨基酸序列顯著更小的免疫原性。本發明專利技術的多肽保持它們結合和/或解聚淀粉樣蛋白的能力。本發明專利技術此外還涉及這些變體g3p-多肽在治療和/或預防與淀粉樣蛋白的錯誤折疊或聚集相關的疾病中的用途。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】【專利說明】包含具有減小的免疫原性的經修飾的噬菌體G3P氨基酸序列 的多肽 本專利技術涉及多肽，所述多肽包含足以結合和/或解聚淀粉樣蛋白的絲狀噬菌體基 因3蛋白（g3p)的一部分，例如，g3p的N1-N2部分及其突變體和片段，其中g3p氨基酸序列已 通過氨基酸取代被修飾來當在體內使用時具有比對應的野生型g3p氨基酸序列顯著更小的 免疫原性。本專利技術的多肽保留它們結合和/或解聚淀粉樣蛋白的能力。本專利技術還涉及這些經 修飾的g3p多肽用于治療和/或預防與淀粉樣蛋白的錯誤折疊或聚集相關的疾病的用途。 已證明絲狀噬菌體g3p蛋白以及特別地包含g3p的N1-N2區的其多肽部分結合并解 聚各種淀粉樣蛋白，諸如淀粉樣蛋白、τ蛋白和朊病毒蛋白。參見共同未決的PCT申請PCT/ US2012/066793以及美國臨時申請US 61 /801，349和US 61 /801，849，所述每一個申請的公 開內容通過引用并入本文。也參見，R.Krishnan等，J.Mol.Biol. (2014)。盡管存在該功效， 但預期包含g3p或其Ν1-Ν2區的多肽的全身性施用可引起有害的免疫答應。然而，這些教導 都未鑒定導致g3p的免疫原性性質的特定T細胞表位或建議此處提供的減少或消除這些免 疫原性性質的特定修飾。 許多重組或另外地非天然治療性蛋白質或多肽的功效可受患者與所述治療性蛋 白質或多肽的不希望的免疫反應限制。蛋白質對免疫響應的誘導的主要因素是蛋白質內的 T細胞表位，即可通過在組織相容性復合物(MHC)II類分子上的呈遞刺激T細胞的活性的氨 基酸序列的存在。T細胞表位通常被定義為具有結合MHC II類分子的能力的任何氨基酸殘 基序列。當結合于MHC分子時，T細胞表位可被T細胞受體(TCR)識別，并可通過銜接T細胞受 體以促進T細胞響應來引起T細胞的活化。然而，通常應理解，結合MHC II類分子的某些T細 胞表位不刺激T細胞響應，因為這些肽在向其施用所述蛋白質的生物體內被識別為"自身 的"。 -些T細胞表位可在治療性蛋白質或多肽在細胞內降解過程中被作為肽釋放，隨 后被MHC的分子呈遞以觸發T細胞的活化。對于由MHC II類分子呈遞的肽，T細胞的此類活化 則可通過直接刺激B細胞產生此類抗體來產生例如所述抗體響應。 MHC II類分子是一組在輔助T細胞選擇和活化中起著中心作用的高度多態的蛋白 質。人白細胞抗原組DR(HLA-DR)是該組蛋白質的占優勢的同種型。然而，同種型HLA-DQ和 HLA-DP進行相似的功能。在人中，已知DR同種型的約70種不同的同種異型，對于DQ，存在30 種不同的同種異型以及對于DP，已知47種不同的同種異型。每一個個體具有2至4個DR等位 基因，2個DQ和2個DP等位基因。 個體中針對蛋白質或多肽的免疫響應嚴重受到T細胞表位識別影響，所述T細胞表 位識別是該個體的HLA-DR同種異型的肽結合特異性的函數。為了在全球人口的背景中鑒定 蛋白質或多肽內的T細胞表位，期望考慮盡可能多樣的一組HLA-DR同種異型的結合性質，從 而覆蓋盡可能高的百分比的世界人口。 T細胞表位鑒定是表位消除的第一步驟。使得能夠檢測T細胞表位的方法在本領域 中是已知的并且公開于WO 98/52976、W0 00/34317、US2007/0269435;US 7,208，147、Kern 等，Nature Medicine4:975_978(1998);和Kwok等，Trends in Immunology 22:583-588 (2001)中。在這些方法中，通過在治療性蛋白質或多肽的一級序列內使用明智的氨基酸取 代來除去預測的或鑒定的T細胞表位。雖然這些參考資料使得能夠進行T細胞表位的假定鑒 定，但避免對生物活性的負面影響的氨基酸取代的選擇不能被合理地預測。這僅可通過測 試經修飾的多肽的每一個的此類活性來測定。 因此，可能期望檢查和減小g3p的N1-N2部分的免疫原性而不破壞其淀粉樣蛋白-結合/解聚性質，以便可為了治療和/或診斷目的長期全身性施用包含N1-N2部分的多肽。本 專利技術通過鑒定N1-N2序列內的潛在T細胞表位來滿足該需要。本專利技術還鑒定了在這些潛在T 細胞表位內的特定氨基酸取代以產生變體N1-N2序列，所述變體N1-N2序列將減少或消除T 細胞表位的免疫原性而不破壞變體N1-N2結合淀粉樣蛋白、阻止淀粉樣蛋白聚集和/或實現 淀粉樣蛋白斑的解聚的能力。 在一個實施方案中，本專利技術還提供了多肽，所述多肽包含N1-N2氨基酸序列的變體 或其突變體或片段，由于一個或多個鑒定的T細胞表位內的一個或多個氨基酸取代而具有 減小的免疫原性。在一個方面，本專利技術提供了包含與人免疫球蛋白Fc區融合的變體NI -N2序 列的融合蛋白。 在另一個實施方案中，本專利技術提供了包含本專利技術的多肽的藥物組合物，以及通過 向患有與錯誤折疊和/或聚集的淀粉樣蛋白蛋白質相關的疾病或對所述疾病易感的受試者 施用此類藥物組合物來治療或預防此類疾病的方法。在其它實施方案中，本專利技術提供了編碼本專利技術的多肽的核酸分子，以及包含那些 核酸分子的載體和具有此類載體的細胞。 在另一個實施方案中，本專利技術提供了用于產生本專利技術的多肽的方法。具體地，此類 方法使用所述核酸分子和/或具有包含此類核酸分子的載體的細胞。 附圖簡述圖1顯示具有5個通過粗體和下劃線標識的T細胞表位的Nl-N2-hIgGl-Fc融合蛋白 的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)。氨基酸1-217構成野生型g3p序列的N1-N2部分。氨基酸218-256代表由存在于M13噬菌體中的野生型g3p的富含甘氨酸的N2-C末端接頭組成的接頭區。 該區域通過陰影來標識。氨基酸257-261代表由用于構建編碼融合蛋白的核酸分子的多克 隆位點編碼的氨基酸。蛋白質的IgG-Fc部分始于氨基酸262。 圖2代表具有4個通過下劃線標識的T細胞表位的g3p-hIgGl-FC融合蛋白（SEQ ID NO:2)的替代實施方案的氨基酸序列。已通過刪除對應于SEQ ID NO: 1的氨基酸258至259的 氨基酸來消除第五T細胞表位。 圖3顯示具有3個通過粗體和下劃線標識的T細胞表位的g3p-hIgGl-Fc融合蛋白 (SEQ ID勵:3)的另一個替代實施方案的氨基酸序列。已通過￥2154和622(^的取代(相較于 SEQ ID NO: 1)消除了第四T細胞表位，以及已通過刪除對應于SEQ ID NO: 1的氨基酸258和 259的氨基酸消除了第五T細胞表位。 圖4A顯示編碼具有N末端哺乳動物信號序列的SEQ ID N0:1的g3p-hIgGl-FC融合 蛋白的DNA序列（SEQ ID NO:4)。圖4B顯示編碼具有N末端哺乳動物信號序列的SEQ ID NO:2 的g3p-hIgGl-Fc融合蛋白的DNA序列（SEQ ID N0:5)。 圖5顯示編碼具有N末端哺乳動物信號序列的SEQ ID N0:3的g3p-hIgGl-Fc融合蛋 白的DNA序列（SEQ ID NO:6)。 圖6提供在實施例1中描述的研究中表達的供體同種異型的頻率的比較。 圖7顯示具有3個通過粗體和下劃線標識的T細胞表位的g3p-hIgGl-Fc融合蛋白 (SEQ ID N0:7)的另本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多肽，其包含起始氨基酸序列的變體，其中所述起始氨基酸序列選自：SEQ?ID?NO:1的氨基酸1?217、SEQ?ID?NO:3的氨基酸1?217、SEQ?ID?NO:7的氨基酸1?217，和具有以下修飾的一個或多個的任何上述氨基酸序列的突變體：氨基酸43?45處AAA對VVV的取代；取代C53W；氨基酸96?103的缺失；氨基酸212?214處AGA對QPP的取代；取代W181A、F190A和F194A；氨基酸1的缺失；和氨基酸1和2的缺失，其中：(a)所述多肽結合和/或解聚淀粉樣蛋白；(b)所述多肽相較于包含所述起始氨基酸序列的對應多肽具有減小的免疫原性；(c)所述變體相較于所述起始氨基酸序列具有1至9個氨基酸取代，其中每一個氨基酸取代選自下文中所示的氨基酸取代的組：和(d)當所述起始氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的氨基酸1?217時，1至9個氨基酸取代的任一個任選地另外選自下文中所示的氨基酸取代的組：
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：FJ卡爾，TD瓊斯，RA費希爾，RGE霍爾蓋特，
申請(專利權)人：神經噬菌體制藥股份有限公司，
類型：發明
國別省市：美國;US
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