大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP以及該熒光蛋白在顯微成像和高靈敏活體生物發(fā)光成像中的應(yīng)用。該熒光蛋白由mNeptune定點(diǎn)誘變獲得，其氨基酸序列第1-230位依次對(duì)應(yīng)于如SEQ?ID?No：2所示的第4-234位，也可通過基因合成該熒光蛋白DNA片段，經(jīng)表達(dá)獲得。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了一種新BRET系統(tǒng)及該系統(tǒng)優(yōu)化得到的融合蛋白Antares。本發(fā)明專利技術(shù)提供的CyOFP可以被青色光激發(fā)，并且擁有很高的量子產(chǎn)率；與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP一起同時(shí)被單色光以雙光子的模式激發(fā)，提高了雙光子成像的分辨率；與熒光蛋白酶NanoLuc形成的新BRET系統(tǒng)，大大提高了活體成像的深度和靈敏度。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像學(xué)
，具體涉及一種大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像學(xué)領(lǐng)域中，熒光蛋白在研究活體細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)水平、蛋白相互作用、蛋白質(zhì)構(gòu)象以及蛋白活性中有著重要的應(yīng)用。但是，在使用熒光蛋白進(jìn)行活體成像時(shí)，往往難以實(shí)現(xiàn)多通道同時(shí)成像，若能突破這一限制，則可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)生物快速反應(yīng)事件的檢測(cè)，將極大推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展。在單光子成像中，可采用由不同激發(fā)波長(zhǎng)的光激發(fā)多種熒光蛋白來實(shí)現(xiàn)多通道同時(shí)成像。然而，在多光子成像中，添加一個(gè)二級(jí)鈦藍(lán)寶石雷射或光學(xué)參數(shù)振蕩器的費(fèi)用較高，并且難以將它們調(diào)控到一起，因此，多種熒光蛋白同時(shí)成像較難實(shí)現(xiàn)。開發(fā)出大斯托克斯位移的熒光蛋白可有效的解決這一問題，實(shí)現(xiàn)同一激發(fā)波長(zhǎng)的光同時(shí)激發(fā)兩種熒光蛋白，然后發(fā)射出不同波長(zhǎng)區(qū)域的光，達(dá)到兩種熒光蛋白多光子同時(shí)成像的目的。該方法具有操作簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求不高、成像效果好等優(yōu)點(diǎn)。目前同時(shí)成像多個(gè)生物分子事件的顯微鏡方法包括，探測(cè)薄樣品的超分辨結(jié)構(gòu)光照明，散射組織中提升分辨率的自適應(yīng)光學(xué)，提高成像速度的隨機(jī)掃描雙光子技術(shù)，以及可以降低光毒性與光漂白同時(shí)又能提高成像速度的光片式照明，它可以通過貝塞爾光束或光學(xué)晶格、非相干聚焦等方式實(shí)現(xiàn)。這些顯微鏡方法均依賴于對(duì)激光的動(dòng)態(tài)調(diào)制，因此，如果想做多色的(雙波長(zhǎng)，多波長(zhǎng))熒光成像就要求多套重復(fù)的光學(xué)器件，以及更加精確的同步控制，這造成了一些技術(shù)難關(guān)。如能開發(fā)出一種大斯托克斯位移的熒光蛋白，并能和常用的綠色熒光蛋白結(jié)合在一起使用，將使兩種不同的生物反應(yīng)事件可視化，大大降低對(duì)光學(xué)器件的高要求。生物發(fā)光由于其不需要光激發(fā)、背景低特點(diǎn)，已成為活體光學(xué)成像的重要手段之一。然而較亮的熒光素酶(通過與底物的生化反應(yīng)而產(chǎn)生光子)不僅量子產(chǎn)率低，而且發(fā)射光子的波長(zhǎng)較短(激發(fā)峰<600nm)，因此限制其在動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)用。基于熒光素酶和熒光蛋白的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)則很好的解決了上述問題。然而，目前基于BRET的生物發(fā)光探針中的紅色熒光蛋白的量子產(chǎn)率相對(duì)較低(<0.4)，而且熒光素酶的發(fā)射光譜與熒光蛋白的吸收譜重疊較少，因此BRET效率較低。因此，需要能夠與現(xiàn)有最亮的熒光素酶(Nluc，發(fā)射峰在460nm)在光譜上有高重疊的熒光蛋白，而且其發(fā)射峰在600nm處。斯托克斯位移指的是熒光物質(zhì)的最大發(fā)射波長(zhǎng)和最大激發(fā)波長(zhǎng)之差。該差值若大于100nm，則認(rèn)為該熒光蛋白具有大斯托克斯位移的特性。大斯托克斯位移的熒光蛋白在多色雙光子成像時(shí)，可保證兩個(gè)不同光譜的熒光蛋白可被同時(shí)熒光成像，并且有效地減少熒光光譜的串?dāng)_。此外，它(受體)可以與熒光素酶(供體)一起在生物體內(nèi)進(jìn)行非輻射的能量轉(zhuǎn)移，也就是生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)。由于BRET不需外源光激發(fā)且背景低，因此生物發(fā)光成像靈敏度非常高，已經(jīng)在蛋白相互作用、活體影像、核酸分析、蛋白酶檢測(cè)及高通量篩選等生物分析相關(guān)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。最早報(bào)道的大斯托克斯位移的熒光蛋白為mKeima，它是一種紅色熒光蛋白，其發(fā)射與吸收峰分別位于440和620nm，采用458nm的光激發(fā)CFP和mKeima，可達(dá)到同時(shí)激發(fā)兩個(gè)熒光分子的目的，從而實(shí)現(xiàn)單光源的多色成像(KogureT，KarasawaS，ArakiT，SaitoK，KinjoM，MiyawakiA.AfluorescentvariantofaproteinfromthestonycoralMontiporafacilitatesdual-colorsingle-laserfluorescencecross-correlationspectroscopy.NatBiotechnol，2006，24:577-581)。但mKeima的缺點(diǎn)在于，它有兩個(gè)激發(fā)峰，除了能在440nm處被激發(fā)，還能在584nm處被激發(fā)，這對(duì)多色成像造成了一些困難。為了克服mKeima的這一缺點(diǎn)，PiatkevichK.D.等人于2010年得到了熒光蛋白突變體LSS-mKate1和LSS-mKate2，這兩個(gè)突變體具有同樣的激發(fā)波長(zhǎng)，但發(fā)射波長(zhǎng)卻不同，因此，可較好的利用它們進(jìn)行雙光子活體觀察腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等生理生化反應(yīng)(PiatkevichKD，HulitJ，SubachOM，WuB，AbdullaA，SegallJE，VerkhushaVV.MonomericredfluorescentproteinswithalargeStokesshift.ProcNatlAcadSciUSA，2010，107:5369-5374)。崔博宇等人在2014年構(gòu)建了一種基于細(xì)菌熒光素酶LuxAB的BRET系統(tǒng)，將LuxAB作為供體，增強(qiáng)型黃色熒光蛋白eYFP作為受體，該系統(tǒng)可有效的接受細(xì)菌熒光素酶LuxAB發(fā)射的藍(lán)色光，并激發(fā)出黃色的熒光，產(chǎn)生明顯的能量轉(zhuǎn)移信號(hào)，進(jìn)一步證實(shí)發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)還能夠檢測(cè)細(xì)菌胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)相互作用(崔博宇.基于細(xì)菌熒光素酶的BRET蛋白相互作用檢測(cè)技術(shù)研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014)。然而，在活體生物體內(nèi)，雙光子同步成像的BRET系統(tǒng)效果并不理想。經(jīng)典的BRET技術(shù)使用受體多為綠色熒光蛋白突變體，體系發(fā)射光較短，活體成像深度較淺；現(xiàn)有的大斯托克斯位移熒光蛋白不能高效的與綠色熒光蛋白一起被激發(fā)，發(fā)射出有別于EGFP的光子，因此雙光子成像靈敏度相對(duì)較低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
為了解決上述存在的技術(shù)問題，本專利技術(shù)的目的在于提供一種大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP，該熒光蛋白是由遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune定點(diǎn)誘變篩選得到的。本專利技術(shù)的另一目的還在于提供上述大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP在顯微成像和高靈敏活體生物發(fā)光成像中的應(yīng)用。本專利技術(shù)的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：一種大斯托克斯位移熒光蛋白，該熒光蛋白是一種突變的遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune，與遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune的氨基酸序列相比，大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP具有以下突變位點(diǎn)：M160K。該突變位點(diǎn)體現(xiàn)了該大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP的大斯托克斯位移特性，具體為mNeptune氨基酸序列的第160位的Met被Lys所取代；其中mNeptune的氨基酸序列的第1-240位對(duì)應(yīng)于如SEQIDNo：1所示的第4-244位。上述的大斯托克斯位移熒光蛋白的氨基酸序列與遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune的氨基酸序列相比，具有以下突變位點(diǎn)：M11S、M15L、S28H、G41N、C61H、T94M、Y96F、C172V、L1本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP，其特征在于：該熒光蛋白是一種突變的遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune，與遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune的氨基酸序列相比，大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP具有以下突變位點(diǎn)：M160K。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP，其特征在于：該熒光蛋白是一種突變
的遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune，與遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune的氨基酸序列相比，大斯
托克斯位移熒光蛋白CyOFP具有以下突變位點(diǎn)：M160K。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP，其特征在于，該熒
光蛋白的氨基酸序列與遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune的氨基酸序列相比，具有以下突變
位點(diǎn)：M11S、M15L、S28H、G41N、C61H、T94M、Y96F、C172V、L174F。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP，其特征在于，該熒
光蛋白的氨基酸序列與遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune的氨基酸序列相比，具有以下突變
位點(diǎn)：H10R、T18S、N21G、H23Q、T38K、T68V、N71K、H72Y、T73P、Q74A、
G75D、I76L、F79Y、C114E、I121V、S128A、A142P、R179K、L187V、Y193H、
H214Y、V216H。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大斯托克斯位移熒光蛋白CyOFP，其特征在于，該熒
光蛋白的氨基酸序列與遠(yuǎn)紅外熒光蛋白mNeptune的氨基酸序列相比，具有以...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：儲(chǔ)軍，張楚秋，王慧娜，郭育奇，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：廣東;44