用于鑒定日本血蜱的靶序列、引物、鑒定方法及試劑盒技術

本發明專利技術提供了用于鑒定日本血蜱的靶序列、引物、鑒定方法及試劑盒，屬于蜱蟲檢測與鑒定技術領域。所述靶序列如SEQ?ID?NO.1所示，是首次擴增出的日本血蜱COI全長序列的一段。本發明專利技術提供了可特異性擴增日本血蜱COI部分序列的引物對，分別如SEQ?ID?No.2-5所示，通過兩次PCR反應可實現對日本血蜱快速、準確的鑒定。本發明專利技術克服了傳統日本血蜱分類鑒定對標本完成性要求高、對鑒定者的專業分類水平要求高等諸多問題，提供的PCR引物及鑒定方法以及試劑盒操作方便，靈敏度高、特異性強、簡單快速、成本低，能夠滿足日本血蜱快速、準確的物種分子鑒定需求，具有良好的應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及蜱蟲檢測與鑒定
，具體地涉及用于鑒定日本血蜱 (Haemaphysalisjaponica)的革E1序列、特異性引物對、鑒定方法及試劑盒。
技術介紹
日本血蜱（Haemaphysalisjaponica)屬硬蜱科，血蜱屬，廣泛分布于我國北方林 區或山地地區（包括黑龍江、吉林、遼寧、河北、寧夏、甘肅、青海和山西等）。其國外分布區 域包括日本、朝鮮以及俄羅斯遠東地區。其成蜱寄生對象范圍較廣，包括馬、山羊、牦牛、野 豬等大型哺乳動物，也侵襲人。其幼蜱和若蜱寄生于鳥類和嚙齒類動物。該蜱是一種重要 的醫學媒介，為森林腦炎的主要傳播媒介。 目前，日本血蜱的物種鑒定主要依靠形態學特征，該鑒定方法對鑒定者的專業知 識和蜱蟲樣本完整性均要求較高，又由于蜱蟲類易與形態近似種混淆，造成日本血蜱的鑒 定結果費時、費力且準確度和重復性都不高。近年來，分子生物學技術已經被廣泛應用于物 種鑒定，目前在日本血蜱的鑒定方面還沒有相關報道，且Genbank數據庫中也沒有日本血 蜱的相關序列信息。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的在于克服現有檢測技術的不足，提供一種用于鑒定日本血蜱 的特異性靶序列。 本專利技術的第二個目的在于提供用于擴增特異性靶序列的引物對。 本專利技術的第三個目的在于提供鑒定日本血蜱的方法及試劑盒。 為實現上述目的，本專利技術首先利用本專利技術設計的蜱蟲C0I全長序列擴增引物對日 本血蜱的C0I序列進行擴增。C0I-CF:5' -ATTTTACCGCGATGAATATTYTC-3'；（SEQIDN0. 6)C0I-CR:5'-TTATTTTAAAATAATRTT-3'（SEQIDNO. 7)。 上述序列中，Y和R分別為兼并引物，Y=C/T，R=A/G。C0I-CF與C0I-CR擴增出日本血蜱的C0I全長序列，長1539bp，其電泳圖如圖1所 不。 本專利技術根據擴增引物C0I-CF和C0I-CR擴增的日本血蜱的C0I全長序列，通過 MEGA軟件中CLUSTALW程序，將該序列與Genbank數據庫中同屬其他血蜱C0I序列進行比 對分析，共設計正向引物3條，反向引物3條。經實際PCR擴增驗證，確定正向引物HJ-F以 及反向引物HJ-R擴增效果良好。HJ-F/HJ-R引物設計BLAST比對結果如圖2, 3所示。但 是，HJ-F/HJ-R擴增特異性較差，如圖4所示。除了日本血蜱，長角血蜱C0I序列也可被擴 增，而調整退火溫度，調整鎂離子濃度都不能消除非日本血蜱相關C0I序列的擴增。為了特 異性鑒定日本血蜱，本專利技術設計了另一對擴增引物，用于擴增非日本血蜱相關C0I序列。本 專利技術根據擴增引物C0I-CF和C0I-CR擴增的日本血蜱的C0I全長序列，通過MEGA軟件中 CLUSTALW程序，將該序列與Genbank數據庫中同屬其他血蜱COI序列進行比對分析，設計 出HL-F/HL-R擴增引物對。經實際PCR擴增驗證，確定HL-F/HL-R可有效擴增非日本血蜱 序列，而不能擴增日本血蜱序列，與HJ-F/HJ-R引物對配合，可特異性鑒定日本血蜱。HL-F/ HL-R引物設計BLAST比對結果如圖4,圖5所示。 日本血蜱特異性引物并進行PCR擴增，獲得300bp的DNA特異性條帶，對其進行測 序、BLAST比對，確定該特異性DNA序列可作為鑒定日本血蜱的特異性DNA序列，用于鑒定 日本血蜱（Haemaphysalisjaponica) 〇 本專利技術首先提供一種用于鑒定日本血蜱（Haemaphysalisjaponica)的革巴序列，其 具有SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。 本專利技術提供了上述靶序列在鑒定日本血蜱中的應用。 用于上述靶序列的特異性引物對屬于本專利技術的保護范圍。 本專利技術提供了特異性擴增上述靶序列的特異性引物組合，包括第1對正向引物 HJ-F:5, -TACCTCCATCCTTATTCTTAC-3,（如SEQIDN0. 2);第 1 對反向引物HJ-R :5' -CACCTGCTAAAACAGGTAGA-3'（如SEQIDΝ0· 3);第 2 對正向引物HL-F :5' -TGCTTGAGCCGGAATGCTAGGTC-3'（如SEQIDΝ0· 4); 第 2 對反向引物HL-R :5' -TAGAACTGATCAAACAAATA-3'（如SEQIDΝ0· 5) 本專利技術提供了上述特異性引物組合在制備鑒定日本血蜱（Haemaphysalis japonica)試劑盒中的應用。 進一步，本專利技術提供鑒定日本血蜱（Haemaphysalisjaponica)的方法，以待測昆 蟲樣品總DNA為模板，以SEQIDNo.l所示的靶序列為目標，分別進行2次PCR擴增，第1 次PCR以SEQIDN0.2、3為引物，第2次PCR以SEQIDN0.4、5為引物，根據兩次擴增產物 電泳的目的條帶判定結果。 更進一步地，若第1次PCR擴增產物電泳結果出現清晰且亮度高的300bp大小的 條帶，并且第2次PCR擴增產物電泳結果不出現清晰的499bp大小的條帶，則待測昆蟲樣本 為日本血蜱。 本專利技術的鑒定日本血蜱（Haemaphysalisjaponica)的方法中，50μ1PCR反應 體系為：l〇XPCRbuffer5yl、10mM上、下游引物各 2yl、10mMdNTPs2yl、50U的Taq酶 1μ1，10~20ngDNA模板2μ1，加滅菌雙蒸水至50μ1 ;PCR反應程序：預熱 94°C，5min;94°C30s，60°C30s，72°C30s，共 36 個循環；延伸 72°C，7min，4°C保存。 本專利技術方法中的2次PCR反應體系和反應程序均相同。 本專利技術還提供一種用于鑒定日本血蜱（Haemaphysalisjaponica)的試劑盒，含有 2個特異性引物對，核苷酸序列分別如SEQIDN0. 2、3所示和如SEQIDN0. 4、5所示。 本專利技術提供了該試劑盒在鑒定日本血蜱（Haemaphysalisjaponica)中的用途。 本專利技術的優點在于，本專利技術填補了目前GenBank中沒有日本血蜱C0I特異性DNA 序列的空白，提供了用于鑒定日本血蜱的靶序列。本專利技術還克服了傳統日本血蜱鑒定對標 本完整性要求高、需要專業分類專家、鑒定成本高等問題，提供的鑒定日本血蜱的PCR引物 及鑒定方法彌補現有檢測技術的不足，操作簡便快捷，靈敏度高、特異性強、簡單快速、成本 低，提高了日本血蜱鑒定的效率和準確性，能夠滿足日本血蜱快速、準確的物種分子鑒定需 求。適用于日本血蜱分布調查，種群分析及相關蜱傳疫病的控制等研究分析工作，具有重要 的理論意義和應用價值。【附圖說明】 圖1本專利技術設計蜱蟲C0I全長序列擴增引物對C0I-CF/C0I-CR，并用引物對擴增 日本血蜱的C0I全長序列^PCR擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M:DL2000Mariier;1 : 1# 日本血蜱（Haemaphysalisjaponica) 圖2為本專利技術設計的日本血蜱第1對正向擴增引物HJ-F序列與Genbank數據 庫以及本專利技術擴增的同屬其他血蜱C0I序列進行BLAST比對分析的結果；其中1 :HJ-F引 物序列；2 :本專利技術擴增的1#日本血蜱（Haemaphysa本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種用于鑒定日本血蜱(Haemaphysalis?japonica)的靶序列，其特征在于，其具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：呂繼洲，林祥梅，吳紹強，張永寧，韓雪清，馮春燕，鄧俊花，
申請(專利權)人：中國檢驗檢疫科學研究院，
類型：發明
國別省市：北京;11