一種新脲酶輔基基因及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一種新脲酶輔基基因及其應用，序列如SEQ?ID?NO.1所示，通過使用本發明專利技術提供的輔基能顯著提高脲酶的活性。重組脲酶包涵體經此復性方案復性后，表現出比只含有結構亞基重組脲酶更高的比酶活。同時也體現出與原始菌中提取的酸性脲酶具有相同的雙功能酶性質，具有脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活，應用前景廣闊。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種輔基新基因及其應用，屬于生物工程

技術介紹
80年代的研究，證實酒精飲料中含有致癌性化學物質氨基甲酸乙酯(EC)，此物在 酒精飲料中主要來源于釀造、煎酒和儲存過程中，酒精飲料內所含尿素和乙醇以非酶催化 的化學反應形成。據報道向發酵酒中添加少量酸性脲酶可以有效去除酒中尿素，進而控制 致癌物質氨基甲酸乙酯含量。本實驗室所構建的重組酸性脲酶具有與來源于普羅維登斯菌JN-B815產酸性脲酶 相同的雙功能酶性質，既能分解尿素，同時也能以EC作為底物最終生成氨氣和水。目前，日本、美國等國研究者不僅篩選到分解酒精飲料中尿素的微生物菌種，研究 了脲酶的酶學特性和應用的條件，并且已有商品化的脲酶投入應用。而我國出口的黃酒中 所用脲酶均從國外進口，國內尚未形成生產規模，而國際關于氨基甲酸乙酯降解酶的報道 也較少。因此研究酒用酸性脲酶特別是同時具有氨基甲酸乙酯降解酶活性的酸性脲酶對我 國釀酒業品質提升具有深遠意義。
技術實現思路
本專利技術的第一個目的提供一種新的脲酶輔基基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。含有所述脲酶基因的基因工程菌、表達載體或克隆載體均屬于本專利技術要求保護的 范圍。本專利技術要解決的第二個目的是提供一種提高脲酶活性的方法，主要涉及所述脲酶 輔基基因在提高脲酶活性中的應用，所述輔基基因與脲酶功能基因共表達。所述共表達為采用獨立啟動子分別表達，具體方法為將權利要求1所述脲酶輔基 基因及脲酶結構基因以雙啟動子表達的方式導入E.coliBL21中得到一種基因工程菌。所述普羅維登斯菌JN-B815由本實驗室篩選，保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏編號:CGMCCNo. 8326。本專利技術的第三個目的是提供重組E.coliBL21(DE3)誘導表達全亞基酸性脲酶包 涵體的方法。 本專利技術的第四個目的是提供一種高純度脲酶包涵體的復性方法。 所述一種胞內表達來源于普羅維登斯菌JN-B815酸性脲酶的重組E.coliBL21 (DE3)的構建方法，是將來源于普羅維登斯菌JN-B815的酸性脲酶結構基因ureABC及脲酶輔 基基因ureEFGD分步導入E.coliBL21(DE3)中得到基因工程菌。利用構建好的工程菌發酵 制備含有全亞基的重組酸性脲酶包涵體，并對酸性脲酶包涵體進行純化及復性。 克隆方法可以采用化學合成法或PCR方法，本實驗以PCR方法為例，但不限于PCR方 法，具體步驟為： (1)用酸性脲酶結構基因序列設計一對引物Fs、Rs(序列分別如SEQIDN0.3、SEQ 10從).4所示），以普羅維登斯菌見-8815基因組為模板擴增出目的基因1^48(：:下劃線表示酶切位點堿基序列。 (2)將目的基因ureABC連接至pET-28a載體上，獲得重組載體①，轉化E.coli JM109涂布于含有含有卡那抗性的LB固體平板上，培養12h，挑取陽性轉化子接種于含卡那 霉素的LB液體培養基中培養12h，提取質粒，進行雙酶切驗證。驗證正確的重組載體送往上 海生工進彳丁測序。 (3)測序正確的重組載體包藏于-20°c冰箱，命名為重組載體①。 (4)用步驟（1)(2)(3)中所述同樣方法構建重組載體②，引物替換為Fa、Ra(序列分 別如SEQIDN0.5、SEQIDN0.6所示），擴增出目的基因序列為ureEFGD: (5)用重組載體②序列設計引物Ft、Rt，擴增出重組載體②上T7啟動子至ureEFGD 序列。并利用步驟（1)(2)(3)中所述同樣方法構建含有雙啟動子及酸性脲酶全基因的重組 載體③。 (6)將重組載體③轉化E.coli BL21(DE3)，獲得重組E.coli BL21(DE3)。并以1% 的接種量接種于50mL的LB中，其中含卡那霉素50yg/mL，NiS〇4〇.05g/L，尿素1%，37°C、 200rpm培養至0D6qq值0.8~1.0之間，加入IPTG至終濃度0.5mM，25°C、200rpm培養10h。 (7)將所得發酵液lOOOOrpm離心lOmin，棄上清，細胞沉淀用10mL25mMpH7.0的 PBS緩沖液重新懸浮，超聲破碎后，離心收集沉淀，獲得脲酶初包涵體。 (8)將脲酶包涵體用BufferI洗滌一次，用BufferΠ洗滌兩次。 (9)將洗滌后的包涵體用含有8M尿素的Bufferin溶解，離心留上清獲得包涵體溶 液。 (10)將步驟(9)中所得包涵體用鎳柱親和層析進行純化。流動相A為含20mM咪唑和 8M尿素的Bufferm，流動相B為含500mM咪唑和8M尿素的BufferΙΠ。 (11)將步驟(10)中的包涵體溶液裝入透析袋中，并將透析袋置于尿素濃度為8M- 0M變化的BufferΙΠ中透析。透析時間為6h，透析溫度為4°C。所述酸性脲酶基因來源于對本實驗室篩選菌株普羅維登斯菌JN-B815提取基因組 進行克隆。酸性脲酶結構基因如SEQ ID N0.2所示及輔基基因如SEQ ID NO. 1所示。 所述表達菌株為大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。 所獲得全亞基酸性脲酶粗包涵體經BufferI、BufferΠ洗滌，以及鎳柱親和層析 進行分離純化，獲得電泳純的酸性脲酶包涵體。 經包涵體純化復性后所得可溶性酸性脲酶，體現出與原始酶相同的雙功能酶活 性。且脲酶與EC降解酶活性比保持原酶一致，約為3:1。此重組脲酶雙功能酶活性均高于只 含有結構亞基的重組脲酶，分別為脲酶比酶活l〇.8U/mg，氨基甲酸乙酯降解酶比酶活為 3.4U/mg。脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活均測于pH為4.5的緩沖液條件下。 酶活測定方法:采用靛酸藍反應(Berthelot reaction)比色法酶活定義:在常壓，37°C，pH4.5條件下，每分鐘分解底物尿素或氨基甲酸乙酯產生lwnol氨為1個酶活力單位。其中，尿素降解酶和氨基甲酸乙酯降解酶活力的測定分別采用 尿素和氨基甲酸乙酯作為底物。本專利技術提供的脲酶輔基基因能顯著提高脲酶的酶活，具有很好的應用前景。此外， 本專利技術設計了一種合適的方法對脲酶包涵體進行復性。證實了該酸性脲酶同時具有氨基甲 酸乙酯降解酶活性，為酸性脲酶在酒類飲料中的應用提供了優良的基礎?！揪唧w實施方式】 LB(g/L):胰蛋白胨10,酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0; Buffer I：50mM PBS,lmM EDTA,pH7.0； Buffer Π：50mM PBS,lmM EDTA,50mM NaCl ,0.3%TritonX-100,pH 7.0； Bufferm:25mM PBS，lmM EDTA，0.2mM GSSG，2mM GSH，20%甘油，1%甘氨酸大腸桿菌E.coli JM109(DE3)、E.coliBL21(DE3)和pET-28a載體由本研究室保藏 T4DNA連接酶、限制性內切酶EcoR I、Sal I、Not I、Xho I以及共用Buffer、瓊脂糖 凝膠電泳Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司。實施例1重組載體①構建方法。為實現酸性脲酶基因在大腸桿菌中的表達，以酸性脲肽酶結構基因ureABC設計一 對基因引物。下劃線表示酶切位點堿基序列。以普羅維登斯菌基因組為模板，Fs及Rs為引物擴增本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種新脲酶輔基基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：田亞平，張遷，朱強，周楠迪，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32